中華獼猴桃多糖提取工藝及生物活性初步研究

宋　潔，馬鳳愛，吳德玲

(1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 安徽　合肥　230031；2 安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽　蕪湖　241000)

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中華獼猴桃多糖提取工藝及生物活性初步研究

宋潔1，馬鳳愛2，吳德玲1

(1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 安徽合肥230031；2 安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽蕪湖241000)

優(yōu)化中華獼猴桃果實(shí)中多糖的提取工藝，并對其生物活性進(jìn)行初步研究。采用單因素試驗(yàn)法，以多糖提取率為指標(biāo)，優(yōu)選出多糖的最佳提取工藝，同時(shí)采用732型陽離子交換樹脂脫蛋白，得到精制多糖；最后，通過秀麗隱桿線蟲模型，初步研究中華獼猴桃多糖的抗衰老活性。結(jié)果表明：優(yōu)選出的多糖最佳提取工藝為提取溫度90 ℃，料液比1:15，提取2次，每次提取1 h；當(dāng)中華獼猴桃多糖含量大于40 μL時(shí)顯示出其對秀麗隱桿線蟲有延長壽命的作用。中華獼猴桃多糖具有一定的抗衰老活性，并有很高的研究價(jià)值。

中華獼猴桃；多糖；優(yōu)選；秀麗隱桿線蟲；抗衰老

獼猴桃，俗稱“水果之王”，藥用歷史悠久，現(xiàn)代研究[1-3]證實(shí)該屬植物的根、莖、果實(shí)等部位具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理活性。其中，多糖被認(rèn)為是其主要活性物質(zhì)之一。20世紀(jì)60年代末，秀麗隱桿線蟲作為經(jīng)典模式生物[4]被推向科研平臺(tái)。目前，秀麗隱桿線蟲[5-8]因其生長周期短，突變體多，易培養(yǎng)，與人類疾病基因存在高度相關(guān)性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。本論文通過優(yōu)選出多糖的最佳提取工藝，并進(jìn)行脫蛋白處理之后，以秀麗隱桿線蟲為模型，對其生物活性進(jìn)行初步研究。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

EYELA SB-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會(huì)社；SHB-III循環(huán)式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；AB135-S十萬分之一分析天平，瑞士METTLER TOLEDO；HH-S26S數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；UV-757CRT紫外分光光度計(jì)，上海棱光儀器有限公司；MiLLi-Q-體式超純水系統(tǒng)，德國默克密理博；單人超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BSP-150生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Motic K-400C體式顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)合肥分公司。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

苯酚，上海中試化工總公司；α-萘酚，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；濃硫酸，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；乙醇，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖對照品，上海中試化工總公司；無水乙醇，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；丙酮，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌(Escherichia coli OP50株)，中國科技大學(xué)生命科學(xué)院光壽紅教授實(shí)驗(yàn)室提供；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3藥材來源

中華獼猴桃，購自陜西省周至縣，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)周建理教授鑒定為獼猴桃科植物中華獼猴桃(ActinidiaChinensis)的果實(shí)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1提取工藝優(yōu)化

選取提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為考察因素，以多糖提取率作為指標(biāo)，優(yōu)選出最佳提取工藝。以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量。多糖提取率采用以下公式計(jì)算：

Y=M×S/W×100%

式中：Y——多糖提取率， %

M——提取得到的多糖質(zhì)量，g

S——提取得到的多糖含量， %

W——中華獼猴桃樣品質(zhì)量，g

2.1.1提取溫度對中華獼猴桃多糖提取率的影響

稱取30 g中華獼猴桃，按照料液比1:10，提取2次，每次1 h，分別設(shè)置提取溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃，再將提取液進(jìn)行濃縮、醇沉、除蛋白、干燥等操作，得到精制中華獼猴桃多糖[9-12]，稱取其重量并進(jìn)行含量測定，計(jì)算出不同提取溫度下，中華獼猴桃多糖的提取率。

2.1.2料液比對中華獼猴桃多糖提取率的影響

稱取30 g中華獼猴桃，按照提取溫度90 ℃，料液比1:5、1:10、1:15、1:20，提取2次，每次1 h，后續(xù)處理同上。

2.1.3提取時(shí)間對中華獼猴桃多糖提取率的影響

稱取30 g中華獼猴桃，按照提取溫度90 ℃，料液比1:15，提取2次，每次提取時(shí)間設(shè)置為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，后續(xù)處理同上。

2.1.4提取次數(shù)對中華獼猴桃多糖提取率的影響

稱取30 g中華獼猴桃，按照提取溫度90 ℃，料液比1:15，每次提取1 h，分別提取1次、2次、3次、4次、5次，后續(xù)處理同上。

2.2抗衰老活性[13-14]檢測

2.2.1線蟲品系

秀麗隱桿線蟲野生型品系N2，由中國科技大學(xué)生命科學(xué)院光壽紅教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

2.2.2供試品制備

精密稱取0.02 g中華獼猴桃多糖溶于1 mL超純水中，充分溶解后用0.22 μm的微孔濾頭過濾，備用。

2.2.3N2的培養(yǎng)及中華獼猴桃多糖對N2壽命的影響

將幼年成蟲時(shí)期的N2進(jìn)行同步化處理，將處理后得到的蟲卵滴至未加菌的NGM板中，20 ℃培養(yǎng)16～18 h，待其長至L1時(shí)期，用M9將L1沖洗下來置于離心管中，備用。將空白的NGM板標(biāo)記空白組、超純水組、20 μL組、40 μL組、60 μL組、80 μL組(如20 μL組，20 μL中華獼猴桃多糖溶液與300 μL OP50混勻加入空白NGM板，依此類推；ddH2O組即取80 μL dd H2O與300 μL OP50混勻加入NGM板中)，將對照組及實(shí)驗(yàn)組的NGM板在超凈工作臺(tái)中鋪好，吹干，備用。

將L1時(shí)期的N2蟲加入到各板中且每板20條，每個(gè)組別分別設(shè)置8個(gè)平行對照組。待N2進(jìn)入排卵期之后，為防止新繁殖個(gè)體與成蟲混淆，每24 h轉(zhuǎn)板一次，直至不產(chǎn)卵為止。每次轉(zhuǎn)板記錄線蟲個(gè)數(shù)，統(tǒng)計(jì)其變化趨勢。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1提取工藝優(yōu)選

3.1.1提取溫度對中華獼猴桃多糖提取率的影響。

表1　提取溫度對中華獼猴桃多糖提取率的影響

圖1　提取溫度對中華獼猴桃多糖提取率的影響

由以上結(jié)果可知，提取溫度為90 ℃時(shí)，多糖的提取率最高。

3.1.2料液比對中華獼猴桃多糖提取率的影響

表2　料液比對中華獼猴桃多糖提取率的影響

圖2　料液比對中華獼猴桃多糖提取率的影響

由以上結(jié)果可知，料液比為1:15時(shí)，多糖的提取率最高。

3.1.3提取時(shí)間對中華獼猴桃多糖提取率的影響

表3　提取時(shí)間對中華獼猴桃多糖提取率的影響

圖3　提取時(shí)間對中華獼猴桃多糖提取率的影響

由以上結(jié)果可知，提取時(shí)間達(dá)到1 h之后，多糖的提取率基本保持一致。從節(jié)約時(shí)間及能源的角度考慮，每次提取的時(shí)間為1 h。

3.1.4提取次數(shù)對中華獼猴桃多糖提取率的影響

表4　提取次數(shù)對中華獼猴桃多糖提取率的影響

圖4　提取次數(shù)對中華獼猴桃多糖提取率的影響

由以上結(jié)果可知，提取次數(shù)為2次時(shí)，多糖的提取率基本保持一致，從節(jié)約時(shí)間及能源的角度考慮，提取次數(shù)為2次。

由以上單因素試驗(yàn)考察結(jié)果以及綜合從時(shí)間、能源節(jié)約的角度考慮，確定以提取溫度為90 ℃，料液比為1:15，提取2次，每次提取1 h的條件作為中華獼猴桃多糖的提取的最佳工藝。

3.1.5驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

取3份中華獼猴桃，按照確定的最佳提取工藝進(jìn)行提取，測定多糖的提取率，驗(yàn)證最佳工藝的合理性。結(jié)果見表5。

表5　驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明此提取工藝切實(shí)可行。

3.2抗衰老活性檢測

表6　中華獼猴桃多糖對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

圖5　中華獼猴桃多糖對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

由表6及圖5的結(jié)果可以看出，中華獼猴桃多糖大于40 μL時(shí)顯示出對秀麗隱桿線蟲有延長壽命的作用，提示中華獼猴桃多糖有一定的抗衰老活性。

4　結(jié)　論

(1)采用單因素試驗(yàn)法對中華獼猴桃多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)選出中華獼猴桃多糖的最佳提取工藝的條件為提取溫度90 ℃，料液比1:15，提取2次，每次提取時(shí)間1 h。對優(yōu)化工藝下提取的多糖采用732型陽離子交換樹脂進(jìn)行脫蛋白處理，并通過秀麗隱桿線蟲，初步研究中華獼猴桃多糖的抗衰老活性，提示其在一定程度上具有抗衰老活性。

(2)為了能更好的研究多糖的藥效活性，對其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化顯得尤為重要。然而，傳統(tǒng)的Sevag除蛋白，工藝流程復(fù)雜、消耗大且不利于工業(yè)生產(chǎn)；活性炭吸附法，在除雜的同時(shí)會(huì)吸附多糖，造成損失；而離子交換法作為一種簡單易行、高效的除雜手段已被廣泛應(yīng)用于食品加工、藥物制備、環(huán)境科學(xué)和化學(xué)工程領(lǐng)域。后期，我們將優(yōu)化多糖的分離純化技術(shù)，并對多糖進(jìn)行質(zhì)量分析，以期為中華獼猴桃的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

(3)隨著對多糖生物活性和藥理作用認(rèn)識的不斷加深，多糖作為無毒副作用的生物活性大分子化合物，已然成為食品科學(xué)、天然藥物、生物化學(xué)以及生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究

者們已相繼證實(shí)銀杏果多糖、蜜環(huán)菌菌索多糖等具有一定的抗氧化、抗衰老作用；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)某些糖蛋白中的糖鏈可介導(dǎo)細(xì)胞間信號的傳遞，并確證其作為信息分子在受精、發(fā)育、分化以及神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮著重要作用，當(dāng)前多糖的研究熱點(diǎn)是結(jié)構(gòu)和功能。目前，有研究表明中華獼猴桃多糖具有延緩衰老的作用，由于多糖中成分的多樣性，其發(fā)揮活性作用的具體成分還有待于進(jìn)一步研究。現(xiàn)階段，隨著核磁共振及質(zhì)譜的普遍運(yùn)用，大力推進(jìn)了糖類的結(jié)構(gòu)分析，但要徹底的深入研究還需綜合生物學(xué)、化學(xué)、藥理學(xué)等各領(lǐng)域的知識。因此，對于中華獼猴桃多糖具有很高的研究價(jià)值和很好的研究前景。

[1]Sun H X, Wang H, Xu H S, et al. Novel polysaccharide adjuvant from the roots of Actinidiaeriantha with dual Th1 and Th2 potentiating activity[J].Vaccine,2009,27: 3984-3991.

[2]閻家麟,王九一,趙敏.中華獼猴桃多糖的提取及其對自由基的清除作用[J].中國生化藥物雜志,1995,16(1):12-14.

[3]Du GR, Li M J, Ma F W, et al. Antioxidant capacity and relationship with polyphenol and Vitamin C in Actinidia fruits[J]. Food Chemistry, 2009,113:557-562.

[4]Brenner S.The genetics of Caenorhabditiselegans[J].Genetics,1974,77(1):71-94.

[5]劉恩岐,倉林讓.模型動(dòng)物秀麗隱桿線蟲研究進(jìn)展[J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué),2003,20(10):110-112.

[6]龐林海,杜愛芳,李孝軍,等.秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)特性與保存方法研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 19(1):34-36.

[7]李有全,關(guān)貴全.秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與保存研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué), 2011,41(10): 1001-1004.

[8]趙晴, 蔣湉湉. 秀麗隱桿線蟲研究綜述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(19):10092-10095.

[9]陳巧巧,蕭偉,萬琴,等.陽離子交換樹脂去除人參多糖中蛋白質(zhì)的研究[J].中草藥,2012, 43(5):910-914.

[10]戴強(qiáng),肖兵南,陳鐵橋,等.732型陽離子交換樹脂分離松乳菇多糖中蛋白質(zhì)的研究[J].湖南高牧畜醫(yī),2009(2):22-23.

[11]張良.中華獼猴桃果中水溶性多糖的分離和純化研究[D].杭州:浙江大學(xué),2002.

[12]王鵬,馬鶯.732陽離子交換樹脂吸附蛋白質(zhì)性能分析[J].中國甜菜糖業(yè),2005(2):41-42.

[13]陳穩(wěn)亮, 張?jiān)苽b,于敏. 蜜環(huán)菌菌索多糖延緩秀麗隱桿線蟲衰老機(jī)制研究[J].中草藥, 2013, 44(04):449-453.

[14]Yang P, Fei J. Caenorhabditiselelgans: the key to the secret of longevity[J]. Chinese Journal of Nature, 2013,35(06):436-441.

The Extraction Process of Polysaccharide in Actinidia Chinensis and its Preliminary Studies of the Biological Activity

SONG Jie1, MA Feng-ai2, WU De-ling1

(1 Anhui University of Chinese Medicine College of Pharmacy, Anhui Hefei 230031；2AnhuiCollegeofTraditionalChineseMedicine,AnhuiWuhu241000,China)

The extraction process of polysaccharide in the kiwi fruit was optimized, the purified polysaccharide was extracted and its biological activity was preliminary studied. Through the single factor experiment method, taking polysaccharide extraction rate as the index, the factors, such as extraction temperature, solid-liquid ratio, extraction time, extraction times, were examined, the best extraction process was optimized. Integrated using DEAE Cellouse-52, Sephadex G-150 and other materials to further purified polysaccharide determination of DPPH radical scavenging ability, and takingC.elegansas a model, kiwifruit anti-aging activity of polysaccharides was preliminary studied. Results showed that through the results of single factor experiment investigation and comprehensive considered from the angle of time and energy saving, it was determined that extract temperature was 90 ℃, solid-liquid ratio was 1:15, extracting 2 times, 1 h each extracted time for the kiwi fruit polysaccharide extraction. Using 732 type cation exchange resin for kiwi fruit polysaccharide composition of removing protein and decoloring, polysaccharide can be refined. Its showed prolong life onC.eleganswhen the content of the kiwi fruit polysaccharide was more than 40 μL. Polysaccharide in Actinidia Chinensis may have certain effect to prolong life, and has a high research value.

Actinidia Chinensis; polysaccharide; optimize;C.elegans; anti-aging

宋潔(1990-)，女，碩士研究生。

吳德玲，教授。

R932

B

1001-9677(2016)01-0083-04