Serratiamarcescens非特異性核酸酶研究進展

張　瑜，鄭　偉，顧劍飛，石陸娥

(杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江　杭州　310016)

?

Serratiamarcescens非特異性核酸酶研究進展

張瑜，鄭偉，顧劍飛，石陸娥

(杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江杭州310016)

Serratiamarcescens核酸酶是一種非特異性核酸內切酶，可降解不同形式的DNA和RNA。本文綜合國內外的研究概況,主要介紹了Serratiamarcescens非特異性核酸酶的水解位點、催化機制及其降解底物的特點，另外也闡述了Serratiamarcescens非特異性核酸酶的原核表達的研究以及其應用現狀，為Serratiamarcescens非特異性核酸酶更深層次的研究提供理論基礎。

Serratiamarcescens；非特異性核酸酶；催化機制；原核表達；應用

非特異性核酸內切酶是一類高活性水解酶，其最大的特點是能非特異地降解幾乎所有類型的核酸，包括單鏈、雙鏈、線狀及環狀的DNA和RNA，且對核酸的序列沒有嚴格的要求。到目前為止，研究人員已從病毒、細菌、真菌和動物中分離得到30余種非特異性核酸酶[1]，其中Serratiamarcescens非特異性核酸酶(SMNE)來源于粘質沙雷氏菌，是一種分泌至胞外的磷酸二酯酶，具有廣闊的應用前景。

1　SMNE的結構

SMNE的一級、二級、三級和四級結構均已被證實[2-5]。通過沉降速度實驗、交聯研究、動態光散實驗及X-射線晶體分析均證明SMNE是由兩個相同的亞基通過羧基末端的氨基酸殘基通過互補作用聚合而成，且兩個亞基中的H184殘基之間的相互作用占主導地位。由圖1A所示，在聚合的兩個亞單位接觸面，A亞基的His-174和B亞基的Ser-179通過非共價連接相互作用。圖1B所示，A亞基的Ser179,Pro180,Ala181,Val182和Asn183形成一定的空間結構與B亞基的His184互補聚合[6]。

圖1　Serratia marcescens非特異性核酸酶的結構

2　SMNE降解核酸

2.1核酸酶的催化作用

DNA中的磷酸二酯鍵極其穩定，在25 ℃，pH 7.0的中性水溶液中半衰期可達千億年。磷酸二酯鍵的高度穩定性被認為是核酸作為遺傳物質的重要原因之一。若使DNA中的磷酸二酯鍵在數分鐘之內發生水解則要求催化劑能夠提供高達1017數量級的速率增強因子[7]。天然核酸酶能加速磷酸二酯鍵1012～1017倍的水解速率，其催化性均靠直接的親核取代反應及構象轉換來實現，這一原則普遍適用于限制性內切酶和非特異性核酸酶。非特異性核酸酶催化磷酸二酯鍵水解實質也是一個親核取代過程，該過程可簡單描述為兩步(圖 2)。第一步，金屬離子活化后的水分子解離產生氫氧根離子，氫氧根離子作為親核試劑攻擊磷原子，形成一個五配位的中間物，這一步是可逆性的；第二步，P-O鍵發生斷裂，帶有3’-羥基的2’-核苷酸離去，形成產物。上述過程中涉及三種基團:活化親核水分子的廣義堿，穩定五價過渡態磷原子上負電荷的Lewis酸(通常為二價金屬離子)和促進3'-羥基離去的廣義酸[8]。

圖2　磷酸二酯鍵水解簡化兩步示意圖

2.2SMNE的催化機制

在非特異性核酸酶中，與催化功能相關的基團通常是由位于活性中心的一些特定氨基酸殘基或二價金屬離子。Miller等[9]發現SMNE的兩個活性位點在裂解核酸的過程中可以獨立的發揮作用。Biedermann[10]等研究發現SMNE的催化活性很高，在它的催化中心，Mg2+與Asn119結合，His89作為廣義的堿，活化親核水分子。Arg 57殘基參與過渡態的穩定，而水化的Mg2+作為Lewis酸，穩定5價過渡態P原子上的負電荷，起質子化離去基團的作用[11]。

SMNE的活性中心參與催化作用的氨基酸殘基為Arg 57，His89，Asn119和Glu127[12]。另外Tyr76和Trp123在所有Serratia核酸酶家族分子的活性位點較為保守，可能是由于核酸殘基間的堆積作用，這些氨基酸殘基的芳香側鏈可能在核酸酶與底物結合時發揮作用。Gregor等[13]獲得了幾種SMNE突變型分子，將Tyr76和Trp123分別突變為Ala和Phe，記作Y76A、Y76F、W123A和W123F。用野生型的酶分子作為對照，結果表明，突變體Y76A和W123A分別引起催化活性降低了104和25倍，而Phe突變體只引起催化活性的略微改變。

2.3SMNE對底物的選擇性

非特異性核酸酶雖然對底物沒有特殊的要求，但其降解核酸時也并非絕對的無堿基優先。通過對非特異性核酸酶ColocinE7[14]的研究表明,在核酸酶的誘導下，DNA骨架容易發生變形的位點更易被核酸酶水解,且通過點突變對ColicinE7進行改造后，其優先水解的位點也可以得到改變，而且核酸酶的活力也得到了提高。

SMNE雖然對底物的特異性要求較低，能降解單鏈、雙鏈、線狀、環狀和超螺旋形式的DNA和RNA，產生5’-磷酸化的單核苷酸、 二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸，但對Poly結構的DNA和RNA降解效率較低。這些特殊結構的DNA和RNA分別作為SMNE的底物時，SMNE無法降解PolyU, PolyG和PolyC結構的底物，也不降解Poly[d(A)]和Poly[d(T)]結構的底物，可微量降解PolyA結構和PolyA·PolyU結構的底物，但可高效降解Poly(I)·Poly(C)這種結構的底物[15]。相對于嘌呤DNA作為底物，其表現出對嘧啶DNA作為底物的偏愛性[16]。

SMNE對底物的降解表現出序列偏愛性[15]。Gregor等設計不同的DNA作為此種核酸酶的底物。在給定的條件下，SMNE傾向于降解dsDNA中GC含量高的序列[17]，尤其是d(G)·d(C)序列，不降解d(A)·d(T)序列。當改變反應體系中的一些指標，SMNE對序列的選擇性發生相應的改變。

3　SMNE的原核表達

SMNE來源于粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，而粘質沙雷氏菌是一種致病菌，其培養菌液用于核酸酶的分離純化存在潛在的風險，因此有必要探索該酶安全高效的重組表達體系。由于核酸酶的胞內表達可能造成重組核酸酶自身核酸的降解而對宿主細胞產生毒性，因此已報道的SMNE的重組表達均采用胞外分泌的方式，但表達效率較低，每升僅可生產1.23×104U的酶。張開俊等[18]通過合成SMNE的基因，應用PCR技術在基因的5'端引入6個組氨酸標簽序列，將其插入分泌表達載體pET-20b(+)中并轉化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，IPTG誘導表達SMNE，表達產物經鎳離子螯合瓊脂糖凝膠進一步純化后，重組蛋白的表達量為8.0 mg/L，純度達到95%，比活達1.1×106U/mg，成功的構建了SMNE的原核高效表達體系。陳鵬等[19]以粘質沙雷氏菌的基因組DNA為模板，PCR擴增非特異性核酸酶(NU)的基因，并克隆到pMAL-c4X載體上構建重組表達載體，重組質粒轉化到大腸桿菌BL21，經IPTG誘導實現胞內78 kDa的麥芽糖結合蛋白-NU融合蛋白，其最佳誘導表達條件為37 ℃，0.75 mmol/L 誘導時間1.5 h。

4　SMNE的應用

非特異性核酸酶已在各領域得到非常普遍的應用，在工業領域中最主要的應用是生物制品中外源核酸的去除[19-20]。在治療用重組生物制品的質量標準中，外源性核酸的殘留量是一個重要的指標，直接關系到產品的安全性。美國FDA和我國SFDA對其殘留量的要求越來越嚴格。美國FDA制定的治療用重組生物制品生產準則規定，成品的外源性核酸殘留量應不超過100 pg/劑[21-22]。此外，SMNE在遺傳機制方面[23]的應用有避免突變、DNA修復、DNA復制和重組、為生長代謝清除核苷和磷酸、宿主防御外源的核酸分子、病毒感染宿主的建立和細胞凋亡等[24]；在醫藥方面如治療腫瘤[25]、纖維性囊腫、紅斑性狼瘡、兒童急性氣喘[26]等；分子研究方面如核酸結構的檢測、RNA的快速檢測、抗病毒試劑的應用等[27]。SMNE已有商品化的產品Benzonase，主要用途是在蛋白質純化的過程中消除核酸的污染，加入該核酸酶可以減小加工處理過程中蛋白樣品的粘稠度。

5　展　望

利用定點突變等技術，結合蛋白質的空間結構研究SMNE的酶學性質，有望為SMNE的功能進化研究奠定一定的理論基礎。SMNE的催化高效性使得其在生物技術領域中具有較為積極的應用價值，尤其是SMNE在蛋白質純化過程中消除核酸污染方面的顯著效果。利用比較成熟的定向進化技術，如DNA改組、易錯PCR等基因突變和高通量篩選等方法，有望加快SMNE的工業化應用。由于核酸酶本身會對宿主細胞造成強的毒害作用，因此構建其原核表達系統以獲得更高核酸酶的表達量有望成為研究的熱點之一。

[1]Li L,Shumei L,Feng Y.Functional identification of the non-specific nuclease from white spot syndrome virus[J].Virology,2005,337(2):399-406.

[2]Ball TK,Saurugger PN,Benedik M J.The extracellular nuclease gene ofSerratiamarcescensand its secretion from Escherichia coli[J].Gene,1987,57(2-3):183-192.

[3]Friedhoff P,Gimadutdinow O,Pingoud A.Identification of catalytically relevant amino acids of the extracellularSerratiamarcescensendonuclease by alignment-guided mutagenesis[J].Nucleic Acids Research,1994,22(16):3280-3287.

[4]Miller MD,Tanner J,Alpaugh M,et al.A structure ofSerratiaendonuclease suggests a mechanism for binding to double-stranded DNA[J].Nature Structural Biology,1994,1:461-468.

[5]Miller MD,Krause KL.Identification of the Serratia endonuclease dimer:structural basis and implications for catalysis[J].Protein Science A Publication of the Protein Society,1996,5(1):24-33.

[6]Franke I,Meiss G,Blecher D,et al.Genetic engineering, production and characterisation of monomeric variants of the dimericSerratiamarcescensendonuclease[J].Febs Letters,1998, 425(3):517-522.

[7]Williams NH,Takasaki B,Wall M, et al.Structure and Nuclease Activity of Simple Dinuclear Metal Complexes: Quantitative Dissection of the Role of Metal Ions[J].Accounts of Chemical Research,1999,32(33):485-493.

[8]高飛,陰彩霞,楊頻.核酸酶催化磷酸二酯鍵水解斷裂的配位化學模擬[J].科學通報,2004,49(15):1472-1482.

[9]Deng P,Tan X,Wu Y,et al.Cloning and sequence analysis demonstrate the chromate reduction ability of a novel chromate reductase gene fromSerratiasp.[J].Experimental&Therapeutic Medicine,2015,9(3):795-800.

[10]Zhu Y,Li H,Hui N,et al.Molecular cloning and characterization of a thermostable lipase from deep-sea thermophile Geobacillus sp.EPT9[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology, 2015,31(2):295-306.

[11]Friedhoff P,Franke I,Meiss G,et al.A similar active site for non-specific and specific endonucleases[J].Nature Structural Biology,1999,6(2):112-113.

[12]Friedhoff P, Meiss G, Kolmes B,et al.Kinetic analysis of the cleavage of natural and synthetic substrates by theSerratianuclease[J].European Journal of Biochemistry,1996,241(2):572-580.

[13]Meiss G,Gimadutdinow O,Haberland B,et al.Mechanism of DNA cleavage by the DNA/RNA-non-specific Anabaena sp. PCC 7120 endonuclease NucA and its inhibition by NuiA[J].Journal of Molecular Biology,2000,297(2):521-534.

[14]Yi-Ting W,Wei-Jen Y,Chia-Lung L,et al.Structural basis for sequence-dependent DNA cleavage by nonspecific endonucleases[J].Nucleic Acids Research,2007,35(2):584-594.

[15]Zhang F,Zhu D,Xie L, et al.Molecular epidemiology of carbapenemase-producing Escherichia coli and the prevalence of ST131 subclone H30 in Shanghai,China[J].European Journal of Clinical Microbiology&Infectious Diseases,2015,34:1-7.

[16]Dawid G,Dariusz P,Sulej AA,et al.Sequence-specific cleavage of dsRNA by Mini-III RNase[J].Nucleic Acids Research,2015,43:2864-2873.

[17]Meiss G,Friedhoff PM,Gimadutdinow O,et al.Sequence preferences in cleavage of dsDNA and ssDNA by the extracellularSerratiamarcescensendonuclease[J].Biochemistry,1995, 34(37):11979-119788.

[18]張開俊,楊莉.Serratiamarcescen非特異性核酸內切酶的原核表達及其應用[J].中國生物制品學雜志,2009(7):667-670.

[19]陳鵬,楊海艷,李慧婧,等.靈桿菌非特異性核酸酶的原核表達、純化及活性分析[J].生物工程學報,2011(8):1247-1257.

[20]Benedik MJ,Strych U.Serratia marcescens and its extracellular nuclease[J].Fems Microbiology Letters,1998,165(1):1-13.

[21]Cooke GD,Cranenburgh RM,Hanak JAJ,et al.A modified Escherichia coli protein production strain expressing staphylococcal nuclease, capable of auto-hydrolysing host nucleic acid[J].Journal of Biotechnology,2003,101(3):229-239.

[22]Xing DKL,Corbel MJ,Dobbelaer R,et al.WHO working group on standardisation and control of acellular pertussis vaccines-report of a meeting held on 16-17 March 2006,St.Albans,United Kingdom[J].Vaccine,2007,25(15):2749-2757.

[23]Song Q,Zhang X.Characterization of a novel non-specific nuclease from thermophilic bacteriophage GBSV1[J].Bmc Biotechnology,2008,8(4):43.

[24]Oliveri M,Daga A,Lunardi C,et al.DNase I behaves as a transcription factor which modulates Fas expression in human cells[J].European Journal of Immunology,2004,34(1):273-279.

[25]陶風云,趙偉,林強,等.中國林蛙卵核糖核酸酶的分離純化及其抗腫瘤作用[J].中國生物工程雜志,2010,30(5):103-109.

[26]陶風云,趙偉,林強,等.中華眼鏡蛇毒核糖核酸酶的分離純化及其特殊生物學活性[J].中國生化藥物雜志,2010,31(3):145-149.

[27]Durward A,Forte V,Shemie SD.Resolution of mucus plugging and atelectasis after intratracheal rhDNase therapy in a mechanically ventilated child with refractory status asthmaticus[J].Critical Care Medicine,2000,28(2):560-562.

Reseach Progress onSerratiamarcescensNon-specific Nuclease

ZHANGYu,ZHENGWei,GUJian-fei,SHILu-e

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Zhejiang Hangzhou 310016，China)

Serratiamarcescensnuclease is a non-specific endonuclease, which is able to cleave different forms of DNA and RNA. The cleavage sites and the catalytic mechanism of the non-specific nuclease ofSerratiamarcescen, its characteristics of the degrade substrate were mainly summarized. In addition, the research on prokaryotic expression and application of this nuclease was briefly introduced in order to provide the theoretical basis for further research ofSerratiamarcescensnon-specific nuclease.

Serratiamarcescens; non-specific nuclease; catalytic mechanism; prokaryotic expression; application

張瑜(1991-)，女，碩士研究生，主要從事微生物資源的開發利用研究。

石陸娥(1979-)，女，副教授，博士，主要從事微生物工程、分子生物學等方面的研究。

Q71

A

1001-9677(2016)05-0016-03