電噴霧質譜技術在中藥分析中的應用*

牛燕燕，鄭彩娟，羅由萍

(海南師范大學化學與化工學院，海南　海口　570100)

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電噴霧質譜技術在中藥分析中的應用*

牛燕燕，鄭彩娟，羅由萍

(海南師范大學化學與化工學院，海南海口570100)

電噴霧電離技術(Electrospray ionization, ESI)是具有高靈敏度的氣相離子軟電離技術。結合中藥有效成分復雜，含量低等特點，從化合物結構分析、中藥質量控制和藥物代謝三方面闡述了ESI-MS技術在中藥分析領域的應用和發展。通過分析離子裂解途徑，對化合物結構進一步確認，指導發現特異性微量化合物；建立中藥有效成分化學指紋圖譜，對中藥質量快速準確控制，確保中藥用藥安全；研究化合物體內代謝途徑及代謝產物，表征化合物藥理效應，指導臨床用藥。

電噴霧電離質譜；裂解途徑；質量控制；藥物代謝

中藥是我國古代勞動人民在長期實踐過程中積累起來的寶貴醫藥遺產，為中華民族的繁衍昌盛做出了重要貢獻，對世界文明的進步產生了積極的影響。我國幅員遼闊，地域差異顯著，有利于構成我國中藥資源的多樣性。因為中藥成分復雜，有效成分含量低，各組分性質各異，對環境(如溫度、濕度等)較為敏感[1]，近年來，一些新型的分析方法和實驗手段應用于中藥研究領域，使得其分析的有效成分種類不斷拓展，分析速度和準確性也不斷提高。電噴霧電離質譜(Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS)是一種大氣壓軟電離質譜技術，具有準確性高、分析速度快、靈敏度高等優點，特別是各種高效分離技術與多種模式的質譜掃描技術聯用，已成為分離分析復雜樣品的首選方法[2-3]。

1　電噴霧電離原理

典型的ESI離子源是一個金屬毛細管，樣品溶液從毛細管端流出并在瞬間受到幾千伏高壓作用，導致待測樣品以單電荷或多電荷離子形式進入高真空離子源。目前，受到廣泛支持的電噴霧離子化原理是“離子蒸發模型”：在高電場梯度和殼層氣作用下，樣品溶液從毛細管流出，在電噴霧針出口端形成細小的帶電液滴，在加熱氣流的作用下，液滴中的溶劑逐漸蒸發，液滴直徑不斷變小，表面電荷密度增加。當液滴表面電荷產生的庫侖斥力大于液滴表面張力時，液滴受靜電斥力而分裂成細小的液滴。這一過程反復進行，直到離子間的靜電排斥力大到一定程度時，揮發度高的離子優先從液滴表面射出，形成氣相樣品離子通過錐孔和聚焦透鏡進入質譜分析器檢測。圖1所示為ESI正離子模式電離示意圖。由于待測樣品在ESI源電離過程中，不涉及高能量的激發過程，不易發生分解，因此容易得到比較完整的準分子離子信號[3-5]。

圖1　ESI正離子模式電離示意圖

2　ESI-MS在中藥分析領域的應用

2.1天然產物分析

中藥化學組成復雜，微量成分多，但同類化合物因具有相同母核結構而在質譜裂解中往往有一定的規律可循。結合已知標準品ESI質譜裂解的分析，可以幫助我們確定中藥中某些復雜的微量化學成分。同時，ESI質譜還能為有機化合物提供準確的分子量信息，對于大分子化合物(如多肽、蛋白質等)，在ESI電離源中可以帶上多電荷，根據不同電荷數離子的質荷比準確計算出大分子化合物的分子質量[6-7]。質子加合物是ESI-MS軟電離源中常見的準分子離子之一，質子化位點關系著進一步的反應機理，影響對整個反應步驟的理解[4]，一般認為，所有的離子裂解都是在電荷或者游離基中心的誘導下發生的，各官能團的電離能大小影響著分子離子的裂解過程[8]，因此，確定最有利的質子化位點對于分析碰撞誘導裂解(CID)過程中質子化分子離子的結構及其隨后的裂解反應是非常有幫助的。此外，借助化合物中活潑氫-氘交換(H/D exchange)方法，可以進一步探尋化合物更高級別的結構[9-11]。

孫學軍等[12]經在線串聯LC-ESI-MS建立了單糖衍生物的電噴霧質譜裂解方法，借助糖類化合物在ESI-MS正離子模式下表現出的質子化分子離子峰和ESI-MS/MS條件下呈現出的特征碎片離子峰m/z 473，快速有效地確定出單糖類化合物的組成。李麗等[13]利用LC-MS技術研究了朝鮮淫羊藿中六個黃酮類化合物，獲得了這些化合物的分子量信息，并進一步借助源內CID技術對化合物結構進行鑒定，結果表明這幾種化合物均產生m/z 531和369的碎片離子峰，結合文獻對比，確定這些化合物是以相同的母核(脫水淫羊藿素)為苷元的黃酮類化合物。丁健樺等[14]采用電噴霧串聯質譜(ESI-MSn)技術，結合H/D交換方法，研究L-抗壞血酸質譜行為，實驗表明毛細管溫度對L-抗壞血酸的裂解方式產生顯著影響。根據L-抗壞血酸特征碎片離子，提出了其結構變化和降解反應的可能機制和基本規律，為現代質譜技術快速測定復雜基體樣品中的痕量 L-抗壞血酸奠定了實驗基礎。L-抗壞血酸在CID裂解時，受其他基團誘導效應的影響，碳原子上的羥基極易接受質子成為質子化的活性位點，并丟失水分子形成伯碳正離子過渡態，進一步氫重排，形成新的更加穩定的碳正離子。同時，L-抗壞血酸在MS2直接丟失中性碎片CO和CO2，但與脫除H2O相比，所需電離能則要大很多。Iyad Hailat等[15]通過ESI-IT-MSn直接進樣研究了人造黃油和玉米油中脂肪酸甾醇酯的質譜行為，實驗表明ESI正離子模式下，加入緩沖劑乙酸銨的脂肪酸甾醇酯極易檢測到[M+NH4]+加合物，甾醇酯同分異構體可以通過MS2和 MS3碰撞誘導裂解來確定結構。

2.2質量控制

中藥的整體作用特點決定了中藥有別于西藥，其質量控制方法對起效的全成分進行有效控制，達到控制中藥質量、保證中藥用藥安全的目的。指紋圖譜質控技術便是有效方法之一[16]，高效的分離方法和質譜快速檢測的分析方法相結合，提供了準確、可靠的質量控制結果。

黃昆[17]使用UPLC-MS技術建立起蘿芙木指紋圖譜的中藥分析方法，不僅節約了研究時間和試劑成本，而且較HPLC具有更高的分辨率和準確度。作者結合文獻，對云南蘿芙木甲醇提取物中利血平、育亨賓、蛇根亭堿、阿嗎堿、阿嗎靈、利血胺、羅尼生、坎尼生八個中藥成分分離并歸屬。其次，對不同產地的云南蘿芙木指紋圖譜分析，確定了42個特征指紋峰，其中共有特征峰22個，并結合質譜和相關文獻，確定了藥材中部分化學成分指紋圖譜的歸屬，通過共有峰面積的比較，說明不同產地的云南蘿芙木存在一定的差異，要實現精準的質量控制，就要進行基地化建設。竇建鵬等[18]以朝鮮淫羊藿藥材乙醇提取部分作為考察對象，建立該藥材的HPLC梯度洗脫指紋圖譜，并采用MSn方法確認了13個共有峰結構，以此作為長白山區朝鮮淫羊藿有效成分的質量檢測標準。周莉莉等[19]利用HPLC-ESI-MSn聯用技術，對傳統中藥山茱萸炮制過程中環烯醚萜苷類成分的變化進行了研究，C18反相色譜柱二元線性梯度洗脫分離得到7個環烯醚萜苷類化合物，并通過ESI一級質譜獲得了分子量信息，利用CID技術，獲得了該類化合物負離子模式下碎裂特征，研究結果表明，通過色譜保留時間、色譜峰面積和質譜特征信息能夠提供更加準確可靠的定性定量結果。劉悅等[20]應用ESI-MSn技術對傳統中藥甘遂根中弱極性部分化學成分進行了分析鑒定，對甘遂氯仿提取物全掃描和串聯質譜掃描數據分析，共鑒定出39個化合物，其中包括9個新化合物。王鵬[21]以蒙古黃芪為原料，研究了黃芪藥材及市售黃芪注射液的特征圖譜，結果顯示雖然都出現了相應的主成分峰，但峰面積比值不同，說明中藥注射劑必須在固定的藥材產地和提取工藝等條件下，才能保證中藥注射劑的質量穩定可控。

2.3藥物代謝和藥物動力學

藥物通過各種途徑進入體內后的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)過程，決定了藥物能否有效到達目標部位并充分發揮療效。ADME血藥濃度隨時間變化動態過程的定量描述即為藥代動力學，對于闡明中藥的藥效物質基礎及作用機理具有非常的意義[22]。HPLC-MS聯用技術樣品預處理簡單，可直接用于藥物及其代謝產物的分離和鑒定[23]。

Lokiec等[24]采用LC/MS和LC-MS/MS研究了20(S)-喜樹堿的半合成衍生物CPT-11在臨床階段的代謝途徑，發現了其體內代謝的三個主要反應：內酯位置的脫羧、7-乙基位置的氧化和二-哌啶側鏈的多級氧化。趙宇峰等[25]利用ESI軟電離質譜技術探討了烏頭堿在人腸內的生物轉化規律，根據正離子電離條件下烏頭類生物堿質子化分子[M+H]+提供的分子量信息和精確質量測定提供的元素組成及MSn提供的結構信息，對烏頭堿的轉化產物直接進行定性分析，研究結果表明，烏頭堿在人腸內細菌環境中通過脫乙酰基、甲基、羥基和酯化反應產生新的單酯型、雙酯型和脂類生物堿等二十余種轉化產物。鐘大放等[26]采用ESI-IT-MS對人尿樣中羅紅霉素及其十種代謝物進行了結構鑒定，通過質譜裂解途徑研究發現，正離子模式下MS2和MS3分別生成脫紅霉糖和脫氨基糖碎片，同時還觀察到脫含氮烷基側鏈和一系列質荷比相差18的脫水碎片離子，這些特征碎片可用于羅紅霉素及其結構類似物的體內代謝轉化研究。

3　展　望

隨著科學技術的不斷進步，各種檢測設備和實驗手段的不斷發展，我們對中藥化學成分的研究已取得了大量有意義的結果，大多數常用的中藥化學成分均有文獻報道[22, 27]，這為中藥現代化研究打下了夯實的基礎。質譜裂解規律的研究不僅可以幫助我們快速分析和確認某些特異性、微量的化合物，同時對新化合物的發現提供了指導依據。與高效的分離技術聯用，可以為復雜的中藥化合物體系快速分析和中藥有效成分體內代謝途徑研究提供準確可靠的研究基礎，這對于中藥質量控制和指導臨床用藥都具有重要的意義。未來對于如何根據已知的質譜裂解實驗數據歸納出具有廣泛適用性的質譜裂解規律，建立能夠全面反映中藥化學組成，突出其主要鑒別特征的化學指紋圖譜數據庫，根據代謝指紋圖譜來表征中藥藥理效應，都將成為中藥研究發展的重要課題，也將成為中藥現代化發展的重要內容。

[1]林泉,呂陽成,駱廣生,等.中藥有效成分快速檢測方法的研究[J].現代化工,2001,21(7):45-48.

[2]蔣宏鍵,俞克佳,譯.電噴霧質譜應用技術[M].北京:化學工業出版社，2005:4-10.

[3]周慧.電噴霧質譜及其聯用技術在藥物分析中的應用[D].浙江:浙江大學,2005.

[4]胡楠.有機化合物在電噴霧串聯質譜中的質子轉移以及裂解理的研究[D].浙江:浙江大學,2010.

[5]侯改芳.海洋天然產物的電噴霧電離質譜(ESI-MS)及其乙酰膽堿酯酶抑制活性構效關系分析[D].山東:中國海洋大學,2013.

[6]LU wen-yuan,YIN xue-fei,LIU xiao-hui,et al.Response of peptide intensity to concentration in ESI-MS-based proteome[J].Science China(Chemistry),2014,57(5):686-694.

[7]YE yong,CAO li-feng,NIU ming-yu,et al.ESI-MS fragmentation pathways of N-methylpyrrole polyamide/peptide conjugates[J].International Journal of Mass Spectrometry,2006,253(1-2):141-145.

[8]歐陽永中.電子轟擊和電噴霧電離源有機質譜裂解規律的量子化學解析[D].湖南:中南大學,2010.

[9]HUANG yi-qun,Marini JA,McLean JA,et al.A mechanistic study of the H/D exchange reactions of protonated arginine and arginine-containing di- and tripeptides[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2009,20(11):2049-2057.

[10]Wing Lam,Ragu Ramanathan.In electrospray ionization source hydrogen/deuterium exchange LC-MS and LC-MS/MS for characterization of metabolites[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2002,13(4):345-353.

[11]Pfeifer Thomas,Tuerk Jochen,Fuchs Regine.Structural characterization of sulfadiazine metabolites using H/D exchange combined with various MS/MS experiments[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2005,16(10):1687-1694.

[12]孫學軍,孫志偉,戶寶軍,等.單糖衍生物的電噴霧質譜裂解規律研究[J].分析化學,2008,36(10):1309-1315.

[13]李麗,竇建鵬,吳巍,等.朝鮮淫羊藿中黃酮類化合物的高效液相色譜與電噴霧質譜聯用研究[J].分析化學,2005,33(3):317-320.

[14]丁健樺,陳煥文,游海珠,等.L-抗壞血酸電噴霧串聯質譜行為研究[J].有機化學,2008,28(11):1971-1977.

[15]Hailat Iyad,Helleur Robert.Identification of fatty acid steryl esters in margarine and corn using direct flow injection ESI-MSnion trap-mass spectrometry[J].International Journal of Mass Spectrometry,2014,362:24-31.

[16]ZHOU li-li,WU guo-guang,LIU zhi-qiang,et al.Studies on the components of crude and processed fructus corni by ESI-MSn[J].Chemical Research in Chinese Universities,2008,24(3):270-274.

[17]黃昆.蘿芙木指紋圖譜研究[D].云南:昆明理工大學,2010.

[18]竇建鵬,宋鳳瑞,劉志強,等.朝鮮淫羊藿的色譜指紋圖譜及液相色譜/電噴霧串聯質譜分析[J].化學學報,2009,67(22):2613-2618.

[19]周莉莉,劉志強,吳國光,等.山茱萸炮制過程中環烯醚萜苷類成分的質譜研究[J].化學學報,2008,66(24):2712-2716.

[20]劉悅,劉志強,李慧琳,等.傳統中藥甘遂根中二萜類化學成分的電噴霧質譜研究[J].高等學校化學學報,2008,29(09):1727-1735.

[21]王鵬.蒙古黃芪中皂苷類成分提取工藝及其體外代謝的初步研究[D].山西:山西醫科大學,2010.

[22]葉敏,果德安.關于中藥質量控制與體內代謝研究的思考[J].化學進展,2009,21(1):100-105.

[23]LIN yan-ping, SI duan-yun, LIU chang-xiao.Detecting and identifying in vivo metabolites of brodimoprim via LC/ESI-MS with data-dependent scanning[J].Chemical Research in Chinese Universities,2008,24(4):430-436.

[24]江波.電噴霧質譜在藥物分析和反應機理研究中的應用[D].安徽:中國科學技術大學,2010.

[25]趙宇峰,宋鳳瑞,國新華,等.利用軟電離質譜技術研究烏頭堿在腸內細菌中的生物轉化[J].高等學校化學學報,2008,29(1):55-59.

[26]鐘大放,田蕾,李雪慶,等.羅紅霉素及其代謝物的電噴霧離子阱質譜研究[J].高等學校化學學報,2000,21(1):31-35.

[27]朱大元.中藥活性成分研究是中藥現代化的重要組成部分[J].化學進展,2009,21(1):24-29.

Application of Electrospray Ionization Mass Spectrometry Technique Used in the Analysis of Traditional Chinese Medicine*

NIUYan-yan,ZHENGCai-juan,LUOYou-ping

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hainan Normal University, Hainan Haikou 570100, China)

The electrospray ionization (ESI) technique is a gas phase soft ionization technique and it can be used for the sensitive detection of large and small molecules in complex samples without sample pretreatment. ESI-MS technology application and development in the field of traditional Chinese medicine modernization expounded from three aspects: compound structure analysis, traditional Chinese medicine quality control and drug metabolism. It predicted the fragmentation pathway of proton ions and the structure of compound to find specific trace compounds. It could control the quality of traditional Chinese medicine quickly and accurately to ensure drug safety through the establishment of effective component chemical fingerprint. Further more, it could characterize the pharmacological effect and guide the clinical medication through the study of compounds in vivo metabolic pathway and metabolites.

electrospray ionization mass spectrometry; fragmentation pathway; quality control; drug metabolism and pharmacokinetic

海南師范大學校青年基金(QN1244)。

牛燕燕(1986-)，女，實驗員，主要從事天然產物研究。

羅由萍(1981-)，女，實驗員，主要從事天然產物研究。

O657.63

A

1001-9677(2016)05-0011-03