液相色譜法測(cè)定乳品中維生素A、D、E含量

吳少明

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建　福州　350002)

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液相色譜法測(cè)定乳品中維生素A、D、E含量

吳少明

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建福州350002)

采用超高壓液相色譜技術(shù)，建立了乳品中維生素A、D、E的測(cè)定方法。即稱取適量樣品，在堿性條件下皂化后進(jìn)行液液萃取，脫水后濃縮至近干，殘余物經(jīng)甲醇溶解定容，過濾膜后進(jìn)樣分析。方法學(xué)驗(yàn)證表明，維生素A、D、E的檢出限在0.2～10 μg/100 g之間，線性關(guān)系良好(R2>0.999)。以奶粉為基質(zhì)，進(jìn)行3水平加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=6)，回收率均在94.0%～99.1%之間，RSD為2.1%～6.1%。該方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可普遍應(yīng)用于乳品中維生素A、D、E的檢測(cè)。

乳制品；維生素A、D、E；高效液相色譜

乳制品中含有非常豐富的維生素A、D、E，是孩子生長(zhǎng)發(fā)育所不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分。近年來，乳制品安全等一系列食品安全事件后， 國(guó)家對(duì)乳制品安全監(jiān)管更加重視，而檢測(cè)能力是保障食品安全的第一道屏障。目前，氣相色譜法，試劑盒法，分光光度法和高效液相色譜法是測(cè)定脂溶性的維生素含量的主要方法[1-13]。但在實(shí)際測(cè)定中，種種原因?qū)е潞茈y獲得穩(wěn)定、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

本文通過對(duì)整個(gè)測(cè)定過程中各因素條件改變對(duì)結(jié)果的影響，建立一種簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確度高的超高壓液相色譜法，可普遍應(yīng)用于乳制品中維生素A、D、E的檢測(cè)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1儀器

超高效液相色譜儀：美國(guó) waters，配制waters PDA 2996 檢測(cè)器。

1.2材料與試劑

維生素A(純度99%)、維生素D2、D3(純度99%)、維生素E(純度98.5%)，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；除乙腈和甲醇為色譜純外其余所用試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件

色譜柱(BEH 柱，2.1×100 mm, 1.7 μm，Waters公司)；流動(dòng)相：甲醇/水(92:8)；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2.0 μL；柱溫：35 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：VA、VD、VE分別為325、265、290 nm。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量維生素A、D、E標(biāo)準(zhǔn)品于各10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，充分混勻得到濃度約為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-24 ℃冰箱中放置保存。再分別取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至濃度為20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中VE為200 μg/mL。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

分別取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液于5個(gè) 10 mL容量瓶中，以甲醇稀釋定容后，制得VA、VD濃度為1.0、2.0、5.0、10、20 μg/mL；VE為10、20、50、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3.4測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取約10 g樣品(液態(tài)為50 mL)，加入1.0 g抗壞血酸、10 g氫氧化鉀、50 mL無水乙醇以及25 mL超純水，搖勻后在60 ℃水浴中皂化20 min，待其冷卻，以兩次100 mL石油醚進(jìn)行新型液液萃取，萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，殘余物經(jīng)甲醇溶解定容，經(jīng)超聲混勻后過 0.45 μm濾膜進(jìn)樣分析。

2　結(jié)果與討論

2.1萃取溶劑

為選取合適的萃取溶劑，以奶粉為基質(zhì)，加入各標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL，分別采用石油醚、正己烷以及乙醚三種溶劑進(jìn)行萃取，其余步驟同1.3.4，重復(fù)3次試驗(yàn)。結(jié)果見圖1，以石油醚萃取結(jié)果最優(yōu)，四種維生素回收率在92.8%～98.4%之間，RSD在2.9%～4.9%之間；正己烷萃取時(shí)次之，回收率在84.3%～97.7%之間，RSD在3.5%～5.6%之間；而當(dāng)以乙醚萃取時(shí)，效果最差，各維生素回收率僅在74.3%～89.3%之間。此外，結(jié)合毒性大小，以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮速度考慮，最終選擇以石油醚作為萃取劑。

圖1　萃取溶劑的影響Fig.1　Effect by extraction solvents

2.2萃取次數(shù)

圖2　萃取次數(shù)的影響Fig.2　Effect by extraction times

為確定洗脫溶劑的體積，仍以奶粉為基質(zhì)，加入各標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL，以3次100 mL石油醚進(jìn)行萃取，分別將第1、2、3次萃取液?jiǎn)为?dú)收集后按步驟1.3.4進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，重復(fù)3次試驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示，第一次100 mL石油醚萃取時(shí)，4種維生素的回收率均在74.6%～83.9%之間，RSD在3.1%～5.0%之間；當(dāng)增至兩次時(shí)，其回收率升至94.6%～99.3%，RSD在3.1%～5.0%之間；增至3次以上時(shí)，結(jié)果與兩次時(shí)相差不大，這說明兩次100 mL的石油醚足以將目標(biāo)物萃取出來，因此選擇100 mL 萃取兩次。

2.3皂化溫度

考慮到奶粉中含有游離脂肪酸會(huì)污染儀器，且目標(biāo)物被蛋白包裹等因素，需對(duì)樣品進(jìn)行皂化處理，而皂化溫度的不同將有可能影響結(jié)果。仍以同樣的奶粉為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)，分別以30、40、50、60、70 ℃下皂化30 min，其余步驟同1.3.3，每種條件重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果見圖3，在30～60 ℃之間，隨著皂化溫度的上升，目標(biāo)物的回收率成遞增趨勢(shì)，回收率由60%升至98.3%，RSD為3.2%～5.1%之間，其可能原因是在此溫度范圍內(nèi)，溫度越高，被包被的目標(biāo)物釋放的更完全；而當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)結(jié)果與60 ℃相近。因此，選擇皂化溫度為60 ℃。

圖3　皂化溫度的影響Fig.3　Effect by temperature of saponification

2.4皂化時(shí)間

皂化時(shí)間的長(zhǎng)短也可能影響結(jié)果，若時(shí)間太短將導(dǎo)致游離脂肪酸去除不全污染儀器，以及目標(biāo)物釋放不完全，而時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)造成浪費(fèi)或者目標(biāo)物分解。因此，有必要對(duì)皂化溫度進(jìn)行優(yōu)化。以同樣的奶粉為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)，分別以0、10、20、30、40 min在60 ℃下皂化，其余步驟同1.3.4，重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果如圖4所示，在0～20 min之間，隨著皂化時(shí)間的延長(zhǎng)，目標(biāo)物的回收率緩慢上升，其原因是由于在此時(shí)間范圍內(nèi)，時(shí)間越長(zhǎng)，被包被的目標(biāo)物釋放的更完全；而當(dāng)增至20 min 以上時(shí)，回收率基本不變甚至有所下降，目標(biāo)物可能分解。在20 min時(shí)最佳，回收率在92.5%～97.9%之間，RSD在2.9%～3.6%之間。因此，選擇皂化時(shí)間為20 min。

圖4　皂化時(shí)間的影響Fig.4　Effect by time of saponification

2.5新型液液萃

實(shí)際樣品經(jīng)皂化后會(huì)形成皂角，在液液萃取時(shí)會(huì)堵住分液漏斗底部，使得液液萃取很難進(jìn)行，嚴(yán)重影響試驗(yàn)的進(jìn)度，特別在進(jìn)行大批量試驗(yàn)時(shí)。考慮到這個(gè)問題，本人設(shè)計(jì)了一種新型的液液萃取裝置如圖5所示，將萃取液從上層直接抽出，輕松地解決了這一難題，大大提高了試驗(yàn)效率。

圖5　新型液液萃取裝置Fig.5　The new liquid-liquid extraction apparatus

2.6石油醚循環(huán)利用

由于每個(gè)樣品需要200 mL的石油醚，消耗量較大，造成成本的同時(shí)也對(duì)環(huán)境也有污染。因此本人試著對(duì)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后收集的石油醚進(jìn)行循環(huán)利用的可行性進(jìn)行試驗(yàn)，從本底、干擾、以及對(duì)儀器的污染程度等進(jìn)行考察。結(jié)果表明回收的石油醚對(duì)再次試驗(yàn)并無影響，完全可以循環(huán)利用。

2.7方法學(xué)指標(biāo)考察

2.7.1檢出限

在奶粉基質(zhì)中，VA、VD2、VD3和VE的檢出限(LOD，S/N=3)分別為0.5 μg/100 g、0.2 μg/100 g、0.2 μg/100 g和10 μg/100 g(見表1)，該方法的檢出限、定量限也較低，可滿足痕量分析要求。

表1　檢出限和回歸方程Table 1　the detection limit and the regression equation

2.7.2線性范圍

以4種維生素的峰面積Y和濃度X(μg/mL)計(jì)算線性回歸方程。在最優(yōu)條件下進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2都在0.9994以上。

2.7.3精密度和準(zhǔn)確度

選取含有較低水平維生素的奶粉為基質(zhì)，將4種維生素標(biāo)樣混合加入，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6次，結(jié)果見表2。4種維生素的回收率在94.0%～99.1%之間，RSD為2.1%～6.1%之間，這說明本方法的重現(xiàn)性(精密度)和準(zhǔn)確度均較為理想，滿足分析的要求。

表2　回收率和RSD測(cè)定結(jié)果 (n=6)Table 2　Recovery and RSD measurement results(n=6)

2.8實(shí)際樣品分析

利用本方法調(diào)查了12種(50份)常見品牌奶粉中的維生素ADE含量(4種維生素的譜圖見圖6。結(jié)果表明，維生素A的含量在206～651 μg/100 g之間；維生素D3的含量在1.2～12.4 μg/100 g之間；維生素E的含量在0.6～12.8 mg/100 g之間；而維生素D2均未檢出(

圖6　維生素A、D、E色譜圖Fig.6　Chromatograms of Vitamin A, D, E

3　結(jié)　論

采用新型液液萃取法，結(jié)合超高壓液相色譜(UPLC)技術(shù)，建立了檢測(cè)乳制品中維生素A、D、E的方法，并對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)比國(guó)標(biāo)GB5413.9[14]所建立的方法更簡(jiǎn)單、快速、靈敏度更高，重現(xiàn)性好。此外，所發(fā)明的新型液液萃取裝置很好了解決了賭塞的情況，且證實(shí)了石油醚可以回收利用，既降低了實(shí)驗(yàn)成本，又減少了環(huán)境污染。并將所建立的方法應(yīng)用的實(shí)際的樣品測(cè)定中，取得了較好的結(jié)果。

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Determination of Vitamin A, D, E from Dairy Products by Ultra High Pressure Liquid Chromatography

WUShao-ming

(National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food, Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, fujian Fuzhou 350002, China)

A new method was established for determination vitamin A, D, E from dairy products by ultra-high pressure liquid chromatography (UPLC) technology. Sample was saponificated under alkaline conditions, and then by liquid-liquid extraction, dehydrated and concentrated to nearly dry, the residue was dissolved in methanol, flitted and analysis. Limit of detection (S/N=3) and limit of quantization of vitamin A, D, E were 0.2～10 μg/100 g. There was an excellent linear correlation (r2>0.999) of vitamin A, D, E. When infant formula powder was spiked with vitamin A, D, E at three levels (n=6), the average recoveries were 94.0%～99.1%, and relative standard deviation(RSD)was 2.1%～6.1%, respectively. The established method is simple, fast high sensitivity, good reproducibility. The method can be adapted to detection vitamin A, D, E from dairy products.

dairy products; vitamin A, D, E; high performance liquid chromatography

吳少明(1986-)，男(漢)，工程師，碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

O657

A

1001-9677(2016)08-0130-04