HPLC法測定不同產地半枝蓮中野黃芩苷的含量*

王　寧，謝春玉，丁　靜，任　燕

(濱州醫學院，山東　煙臺　264003)

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HPLC法測定不同產地半枝蓮中野黃芩苷的含量*

王寧，謝春玉，丁靜，任燕

(濱州醫學院，山東煙臺264003)

采用高效液相色譜技術，測定不同產地半枝蓮中野黃芩苷的含量。采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，乙腈(A)-水溶液(0.1%醋酸，B)為流動相，梯度洗脫(0～60 min，5%～30%A；60～70 min，30%～100%A)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長335 nm，進樣量20 μL。結果不同產地半枝蓮中野黃芩苷的含量分別為江西1.08%、河南0.74%、湖南1.06%、四川0.61%、江蘇0.91%、山東1.66%、河北0.39%、安徽0.54%。本實驗所建立的方法簡單、準確，能為評價半枝蓮的內在質量提供一定的依據。

半枝蓮；野黃芩苷；高效液相色譜

半枝蓮是唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbarta D. Don的干燥全草。別名通經草、紫連草等[1]，性辛、寒，味苦，有清熱解毒、化瘀利尿的功效，半枝蓮常用于疔瘡腫毒，咽喉腫痛等的治療[2]。現代藥理學證明半枝蓮藥理作用廣泛，具有抗腫瘤、抑菌、抗病毒和免疫調節等方面的作用[3]。《中華人民共和國藥典》2015版中，半枝蓮藥材的質量主要通過總黃酮及野黃芩苷的含量來評價。黃酮類化合物是半枝蓮中主要的有效成分，含量最多的為野黃芩苷[4-7]。半枝蓮中野黃芩苷含量的高低與其療效有相關性。為評價半枝蓮的質量，本實驗采用高效液相色譜法對八個不同來源的半枝蓮藥材中的野黃芩苷進行了含量測定，為充分利用半枝蓮藥材資源提供一定的參考。

1　實　驗

1.1儀器與試藥

Waters 高效液相色譜儀；KQ5200B型超聲清洗器,昆山市超聲儀公司；TDL-4低速臺式離心機,上海安亭科學儀器廠；TB-215D電子分析天平,丹佛儀器有限公司。

野黃芩苷(批號：S107670)購自上海晶純生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，乙酸為分析純，水為超純水。藥材來自四川、山東、河南等8 個產區，由濱州醫學院藥學院生藥學教研室陳彩云鑒定為唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbata D. Don的干燥全草。

1.2實驗方法

1.2.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水溶液(0.1%醋酸)，梯度洗脫(0 min，乙腈5%，水95%；60 min，乙腈30%，水70%；70 min，乙腈100%)；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為335 nm；進樣量為20 μL。色譜圖見圖1。

圖1　半枝蓮樣品(A)和野黃芩苷對照品(B)的HPLC圖Fig.1　The HPLC chromatogram of scutellaria barbata (A) and scutellarin (B)

1.2.2對照品溶液的制備

準確稱取野黃芩苷對照品2 mg，加甲醇定容至10 mL，配制成濃度為200 μg/mL的對照品標準儲備溶液。儲備溶液用甲醇按一定比例稀釋，最終配制成濃度為2、4、20、50、100、200 μg/mL的系列濃度對照品工作溶液。

1.2.3供試品溶液的制備

分別精密稱取不同產地半枝蓮粉末約0.05 g，置于10 mL離心管中，然后加入70%甲醇5 mL，搖均后超聲1.5 h，提取液4500 rpm離心10 min，取上清液即為供試品溶液。

1.2.4線性關系考察

精密吸取野黃芩苷系列濃度對照品工作溶液20 μL，注入高效液相色譜，根據上述的色譜條件進行測定，以野黃芩苷的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=60647X+118064，R=0.9936。結果說明野黃芩苷在2.04～204.5 μg/mL線性關系良好。標準曲線見圖2。

圖2　野黃芩苷標準曲線Fig.2　The calibration curve of scutellarin

1.2.5精密度試驗

表1　精密度試驗結果(n=6)Table 1　The results of precision (n=6)

取同一濃度的野黃芩苷對照品溶液(濃度：20 μg/mL)，連續進樣6次，野黃芩苷峰面積的RSD為3.96%，表明儀器精密度良好。結果見表1。

1.2.6重復性試驗

取同一產地的半枝蓮樣品(河南)，按“1.2.3供試品溶液的制備”方法處理，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下測定峰面積，結果野黃芩苷峰面積的RSD為3.45%，表明重復性良好。結果見表2。

表2　重復性實驗結果(n=6)Table 2　The results of repeatability (n=6)

1.2.7穩定性試驗

取半枝蓮樣品(河南)一份，按“2.3供試品溶液的制備”方法處理，分別于0、4、8、12、16、20 h分別測定，結果野黃芩苷峰面積的RSD值為4.02%，表明樣品處理后20小時內穩定。結果見表3。

表3　穩定性實驗結果(n=6)Table 3　The results of stability (n=6)

1.2.8加樣回收率測定

精密稱取已知含量的樣品(河南)6份，分別加入與供試品等量的對照品，平行制備6份供試品溶液，測定峰面積，根據標準曲線計算加樣收率，其回收率在100.0%～108.1%(RSD=3.14%)，表明測定方法穩定可靠。結果見表4。

表4　加樣回收試驗結果(n=6)Table 4　The results of recovery (n=6)

1.2.9樣品的測定

精密稱取不同產地的半枝蓮樣品，照“1.2.3”項下方法制成供試品溶液，照“1.2.1”項下色譜條件，測定含量，結果見表5。

表5　不同產地半枝蓮中野黃芩苷含量測定結果Table 5　The contents of scutellarin in herba scutellaria barbata from different places

2　結果與討論

2.1樣品前處理方法的優化和選擇

分別精密稱取等量的同一種半枝蓮粉末，置于10 mL離心管，然后分別加入70%甲醇和95%甲醇5 mL，超聲1.5 h，4500 rpm離心10 min，取上清液在相同的色譜條件下進行測定，結果采用70%甲醇超聲提取峰面積相對較大。最終確定提取條件為70%甲醇超聲提取1.5 h。

2.2流動相的選擇

本實驗直接采用乙腈(A)-水(0.1%醋酸，B)作為流動相系統，通過更改洗脫梯度來進行優化和選擇。本實驗分別采用條件1(0 min，5%A；60 min，30%A；70 min，100%A)和條件2(0 min，5%A；5 min，15%A；70 min，40%A；80 min，60%A)來分離半枝蓮中的野黃芩苷。根據實驗結果，采用條件1分離效果良好，半枝蓮與其他成分達到基線分離，且分析時間相對較短，所以最終選擇此條件作為本實驗的流動相的洗脫條件。

2.3檢測波長的選擇

本實驗直接采用文獻報道的野黃芩苷[7]的檢測波長335 nm作為檢測波長。

2.4含量測定

根據測定結果可以看出，各產地半枝蓮中野黃芩苷的含量均超過了0.30%，達到了《中華人民共和國藥典》2015版中規定的半枝蓮藥材中野黃芩苷含量的要求。本次實驗測定的8個產地半枝蓮中野黃芩苷的含量分別為：江西1.08%、河南0.74%、湖南1.06%、四川0.61%、江蘇0.91%、山東1.66%、河北0.39%、安徽0.54%。由結果可以看出，不同地區半枝蓮中野黃芩苷的含量差別較大，山東產地的半枝蓮藥材中野黃芩苷的含量最高，這提示我們在中藥復方及成方制劑中應盡可能的選擇山東產半枝蓮，在所需的半枝蓮的量相同的情況下藥效能相應得到提高，保證臨床用藥的安全性與有效性。

3　結　論

本實驗建立了HPLC法測定不同產地半枝蓮中野黃芩苷的含量測定方法。樣品前處理方法簡單，分析時間適宜，所建立的方法簡便、靈敏、準確，適合對不同產地半枝蓮中的野黃芩苷進行準確的含量測定，實驗結果為半枝蓮的質量評價提供了一定的依據。

[1]黃泰康. 常用中藥成分與藥理手冊[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 1997:127.

[2]邸多隆,劉春麗, 劉曄瑋,等. 半枝蓮提取工藝的研究[J]. 中成藥, 2003, 25(7): 530-532.

[3]楊連梅,劉量,胡榮,等. 半枝蓮化學成分的提取和含量測定方法研究[J]. 江蘇中醫藥, 2010, 42(2): 78-79.

[4]楊連梅, 劉量, 胡榮, 等. 半枝蓮化學成分的提取和含量測定方法研究[J]. 江蘇中醫藥, 2010, 42(2): 78-79.

[5]H Yao, S Li, J Hu, et al. Chromatographic fingerprint and quantitative analysis of seven bioactive compounds of Scutellaria barbata[J]. Planta Med, 2011, 77(4): 388-393.

[6]F Zhu, Y-T Di, L-L Liu. Cytotoxic neoclerodane diterpenoids from Scutellaria barbata[J]. J Nat Prod, 2010, 73(2): 233-236.

[7]李守拙, 潘海峰. HPLC測定半枝蓮中野黃芩苷的含量[J]. 中草藥, 2003, 34(2): 183-184.

Determination of Contents of Scutellarin in Herba Scutellaria Barbata from Different Places by HPLC

WANGNing,XIEChun-yu,DINGJing,RENYan

(Binzhou Medical University, Shandong Yantai 264003, China)

The content of scutellarin of herba scutellaria barbata derived from different places was determined by HPLC. The analysis was carried out on an Agilent ZORBAX SB-C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) eluted with acetonitrile-water (0.1% acetic acid) in linear gradient condition (0～60 min, 5%～30%A, 60～70 min, 30%～100%A). The detection wavelength was 335 nm, the temperature of the column oven was 30 ℃, the flow rate was 1 mL·min-1, and the sample injection volume was 20 μL. As a result, the contents of scutellarin in herba scutellaria barbata from Jiangxi, Henan, Hunan, Sichuan, Jiangsu, Shandong, Heibei, Anhui were 1.08%, 0.74%, 1.06%, 0.61%, 0.91%, 1.66%, 0.39%, 0.54%, respectively. The established method was simple, accuracy, and the results can provide useful reference date for evaluate the intrinsic quality of herba scutellaria barbata.

scutellaria barbata; scutellarin; HPLC

山東省高等學校科技計劃(J13LL80)；山東省自然科學基金(ZR2013HL006)。

王寧(1992-)，女，濱州醫學院學生，藥學專業。

任燕(1982-)，女，濱州醫學院講師，博士學位，主要從事藥物分析研究。

R917

A

1001-9677(2016)08-0117-03