黃瓜香水提取物對四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的影響*

謝葉青，李春艷，侯思雨，黃　樂，孟海風(fēng)，吳遠(yuǎn)銘

(1 吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南　吉首　416000；2 吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)教研室，湖南　吉首　416000)

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黃瓜香水提取物對四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的影響*

謝葉青1，李春艷2，侯思雨1，黃樂1，孟海風(fēng)1，吳遠(yuǎn)銘1

(1 吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000；2 吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)教研室，湖南吉首416000)

探討黃瓜香對肝纖維化大鼠肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及生長轉(zhuǎn)化因子β1(TGF-β1) 表達(dá)的影響。將 48只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、生理鹽水組和黃瓜香干預(yù)組,分析儀檢測血清ALT、AST、ALP、HA、LN、PCⅢ型膠原，HE染色顯示肝的顯微結(jié)構(gòu)，SABC法免疫組織學(xué)染色顯示 α-SMA及 TGF-β1。結(jié)果表明：與模型組和生理鹽水組比較, 黃瓜香組ALT、AST、ALP、HA、 LN、PCⅢ型膠原含量均明顯降低(P<0.01)；黃瓜香干預(yù)組有較正常肝小葉結(jié)構(gòu),少見纖細(xì)的纖維間隔,有炎性細(xì)胞少量浸潤；模型組、正常對照和黃瓜香干預(yù)組α-SMA及TGF-β1表達(dá)的平均灰度值比較均有顯著性差異(P<0.01)。黃瓜香可明顯減少纖維化組織面積,其在治療肝纖維化方面有開發(fā)價(jià)值。

肝纖維化；黃瓜香；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；生長轉(zhuǎn)化因子β1；大鼠

肝纖維化(hepatic fibrosis)是機(jī)體對慢性損傷的一種修復(fù)性反應(yīng)，病理學(xué)基礎(chǔ)主要涉及肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM)大量異常地沉積。現(xiàn)認(rèn)為肝纖維化早期有逆轉(zhuǎn)的可能，因而促進(jìn)了天然藥物抗肝纖維化的研究，在前期黃瓜香的實(shí)驗(yàn)探討中，顯示了其一定的保肝護(hù)肝作用[1]。因此，通過免疫組化法檢測經(jīng)典的CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠肝組織中的TGF-β1和α-SMA的表達(dá),研究黃瓜香對肝纖維化的影響作用。

1　實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑

黃瓜香(Viola diffusa Ging，VDG)來源堇菜科堇菜屬蔓莖堇菜的全草，采自湖南湘西，由湘西民族醫(yī)藥研究室提供鑒定；CCl4為中國聯(lián)化化工試劑有限公司上海制造，分析純，批號20041022；95%醫(yī)用乙醇；ALT試劑盒, 批號 010021；AST

試劑盒, 批號020071；ALP試劑盒,批號030261,以上均購自于北京中生北控生物科技股份有限公司。 HA、LN、PCⅢ 肝纖維化酶聯(lián)免疫試劑盒，鼠抗α-SMA單抗、兔抗TGF-β1單抗、SABC二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒均由武漢博士德生物公司提供。

1.2分組及取材

48只雄性清潔級Wistar大鼠, 質(zhì)量(180±20) g,由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)分為4組即模型組、正常對照組、生理鹽水組和黃瓜香藥物組，每組12只，將CCl4與豆油配成60%的濃度, 生理鹽水組、模型組和藥物干預(yù)組皮下注射，大鼠下腹區(qū)左右交替進(jìn)行, 首劑0.2 mL, 以后每3～4天注射1次, 劑量為0.1 mL, 飲用10%乙醇。實(shí)驗(yàn)時(shí)間共持續(xù)6周[2]。正常對照組同上操作，飲用純凈水，皮下注射豆油，在造模同時(shí)，正常對照組及生理鹽水組0.9%NaCl灌胃，藥物干預(yù)組給予0.75 g/mL黃瓜香水提物灌胃1 mL/100 g,每天1次。

最后1次操作后大鼠全部禁食不禁水，2天后處死取肝臟切片，病理學(xué)檢查。HE、免疫組化染色觀察。腹主動(dòng)脈取血,靜置, 3500 rpm離心15 min分離血清, 4 ℃冷藏備用。

1.3肝臟形態(tài)學(xué)觀察和HE染色觀察

觀察大鼠肝臟的表面光滑程度、顏色、質(zhì)地,結(jié)節(jié)有無等。切片觀察肝小葉結(jié)構(gòu)狀態(tài)、肝板排列情況、中央靜脈膠原纖維的變化等。

1.4大鼠肝功能及血清肝纖維化指標(biāo)檢測

血清4 ℃冷藏備用，PCR檢測 ALT、AST、ALP。ELISA測定大鼠血清中HA、 LN、PCⅢ型膠原，所有檢測遵照試劑盒說明操作。

1.5α-SMA及 TGF-β1免疫組織化學(xué)染色和圖像分析

SABC法免疫組化染色顯示α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及生長轉(zhuǎn)化因子β1(TGF-β1)每組選15張切片，放大倍數(shù)為200鏡下選取1個(gè)視野，測定灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，顯著性差異P值<0.05，極顯著性差異P值<0.01。

2　結(jié)　果

2.1黃瓜香對大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響

圖1　正常對照組大鼠肝組織 (HE染色 ×200)

圖2　模型組大鼠肝組織 (HE染色 ×200)

圖3　生理鹽水組大鼠肝組織 (HE染色 ×200)

圖4　干預(yù)組大鼠肝組織 (HE染色 ×200)

①正常對照組: 無異常病理改變，匯管區(qū)清晰可辨，有結(jié)構(gòu)完整的肝小葉,無明顯炎細(xì)胞浸潤(圖1);②模型組: 肝小葉界限模糊,膠原纖維包繞分割肝小葉, 多個(gè)點(diǎn)狀或大片狀壞死出現(xiàn)在小葉內(nèi)、有部分肝細(xì)胞脂肪變性,匯管區(qū)見很多炎癥細(xì)胞浸潤(圖2);③生理鹽水組: 膠原纖維增生、壞死的范圍和炎性細(xì)胞的浸潤比模型組減少,但仍比較嚴(yán)重(圖3);④藥物組:肝小葉正常,少見纖細(xì)的纖維間隔, 炎性細(xì)胞浸潤偶見(圖4)。

2.2黃瓜香水提物對肝功能及血清肝纖維化指標(biāo)的影響

模型組大鼠血清ALT、AST、ALP 活性較正常，對照組、生理鹽水組和干預(yù)組顯著升高(P<0.01),顯示肝細(xì)胞被破壞，胞內(nèi)酶大量溶出；藥物干預(yù)組與生理鹽水組比較，血清ALT、AST、ALP活性顯著降低(P<0.01),與對照組比較,模型組HA、 LN、PCⅢ 含量，顯著增加(P<0.01),說明造模成功,黃瓜香干預(yù)組與模型組比較,血清HA、 LN、PCⅢ 含量顯著降低(P<0.01)。

表1　黃瓜香水提物對大鼠血清ALT、ALP、AST、 HA、 LN、PCⅢ的影響

注:與正常對照組和生理鹽水組比較,★P<0.01,與模型組比較,▲P<0.01。

2.3黃瓜香水提物對肝細(xì)胞α-SMA及 TGF-β1表達(dá)的變化

免疫組化染色α-SMA及 TGF-β1陽性者棕黃色。正常對照組血管壁上有少許棕黃色的著色顏色淺。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,肝細(xì)胞索紊亂,著色明顯增多色深。生理鹽水組與模型組接近。藥物干預(yù)組有少量著色,且著色明顯較模型組變淡。

表2各組大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1免疫組化檢測結(jié)果

Table 2　The expression of α-SMA and TGF-β1 in rats

組別例數(shù)α-SMATGF-β1正常對照組12102.4±28.7113.2±29.4模型組10153.2±21.1★161.2±20.6★生理鹽水組12112.5±19.5122.6±38.5干預(yù)組11131.7±26.4▲△149.1±21.2▲△

注：與正常對照組比較,★P<0.01;與模型對照組比較,▲P<0.01;與生理鹽水組比較,△P<0.01。

3　討　論

肝組織α-SMA表達(dá)以及血漿TGF-β1變化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的重要風(fēng)向標(biāo)，肝纖維化是多種原因引起的纖維結(jié)締組織在肝臟內(nèi)增生,細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM)的合成增多降解減少，致使肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的病理過程。研究認(rèn)為肝纖維化形成以肝細(xì)胞壞死和慢性炎癥為前提;炎性介質(zhì)激活肝臟枯否氏細(xì)胞(Kupffercells,KC)釋放大量細(xì)胞因子和活性氧為中間環(huán)節(jié);繼之肝星狀細(xì)胞(Hepaticstellatecells,HSC)被激活,合成以膠原為主的ECM沉積于肝組織等三個(gè)階段。其中枯否氏細(xì)胞是肝纖維化形成過程中肝臟炎癥反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞,而肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化關(guān)鍵事件。因此干預(yù)HSC的生物學(xué)行為能成為成功防治肝纖維化的有效手段[3-4]。

生長轉(zhuǎn)化因子(TGF-β1)是目前已知的最強(qiáng)的致纖維化多功能的細(xì)胞因子,強(qiáng)烈地影響著和肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的生物學(xué)性狀[5-6]。基于生長轉(zhuǎn)化因子與肝纖維化息息相關(guān),因此有效干預(yù)生長轉(zhuǎn)化因子(TGF-β1)的表達(dá)，有良好的延緩和逆轉(zhuǎn)纖維化的作用。

黃瓜香(VDG)為多年生草本植物，來源于堇菜科堇菜屬蔓莖堇菜的全株入藥，鮮草揉碎后有較強(qiáng)烈的黃瓜氣味而得名，全草有清熱解毒，消腫排膿之功，主治肝炎。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用黃瓜香灌胃治療四氯化碳造模成功的肝纖維化的模型大鼠,證實(shí)對肝纖維化的大鼠有很好的保護(hù)作用。其機(jī)理可能與黃瓜香能抑制α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及生長轉(zhuǎn)化因子β1(TGF-β1)的表達(dá)有密切的關(guān)系。

4　結(jié)　論

肝臟疾病為常見的影響人類健康的疾病之一，目前以中醫(yī)藥科研新成果阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化已成為一個(gè)新的有效治療方法。較理想的抗肝纖維化藥物應(yīng)具有良好耐受性，對肝臟有特異的靶效應(yīng)，無毒或低毒，天然藥物及中草藥在這方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，黃瓜香對α-SMA及TGF-β1的表達(dá)有一定的抑制作用，能明顯減少纖維化組織面積，降低肝損傷的程度，證實(shí)了其良好的保肝護(hù)肝作用。

[1]李先輝,李春艷,呂江明,等.黃瓜香水提物體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)[J].吉首大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(5):95-97.

[2]劉恒興,邵鋒,王環(huán)震,等.β-2胡蘿卜素對肝纖維化大鼠肝組織 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,25(1):5-7.

[3]Schoemaker MH,Ros J E,Homan M, etal. Cytokineregulation of pro-and anti-apoptotic genes in rat hepatocytes: NF-kappaB regulated inhibitor of apoptosis protein2(cIAP2) prevents apoptosis[J].Journal of Hepatology,2002,36(6):742-50.

[4]翁榕安,李先輝,李春艷.黃瓜香提取物對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原及生長轉(zhuǎn)化因子β1表達(dá)的影響(J).食品科技,2010,35(8):271-277.

[5]Sanz S, Pucilowska JB,Liu S, et al. Expression of insulin-like growth factorⅠby activated hepatic stellate cells reduces fibro-genesis and enhances regeneration after liver injury[J]. Gut,2005,541:134-141.

[6]吳繁榮,陳飛虎,胡偉.鬼針草總黃酮對免疫性肝纖維化大鼠膠原代謝的影響及機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2012,28(4):504-7.

The Effect of VDG on Hepatic Fibrosis by Carbon Tetrachloride in Rats*

XIEYe-qing1,LIChun-yan2,HOUSi-yu1,HUANGLe1,MENGHai-feng1,WUYuan-ming1

(1 College of Medicine, Jishou University, Hunan Jishou 416000;2 Staff room of function, College of Medicine, Jishou University,Hunan Jishou 416000, China)

The effects of VDG on the expression of smooth muscle actin alpha(α-SMA) and transforming growth factor-β1(TGF-β1)in rats with hepatic fibrosis were studied. Forty-eight rats were randomly divided into four groups: normal control group, model control group, normal sodium group and interrupt group. The contents of ALT, AST, ALP, HA, LN and PCⅢ were measured by full automatic biochemical analyzer and ELISA, hepatic microstructure was showed by HE staining,the expression of α-SMA and TGF-β1was showed by immunohistochemistry dyeing. Compared with the model group, the contents of ALT, AST, ALP, HA、LN and PCⅢ remarkably decreased(P<0.01). In interrupt group, the hepatic lobe structure was normal, the slender textile fiber gap was minority, and there was the few inflammatory cell infiltration. There was significant difference in the average grey degree of α-SMA and TGF-β1among normal control group, model control group and interrupt group (P<0.01). The alcohol extract from VDG showed the protective effects for liver fibrosis and could alleviate the degree of degeneration and necrosis induced by CCl4.

hepatic fibrosis; viola diffusa ging; smooth muscle actin alpha; transforming growth factor-β1; Rats

吉首大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(No：教通[2014]34號)；吉首大學(xué)2015年度醫(yī)學(xué)類專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No: JDYXCX201512) ；吉首大學(xué)2015年度醫(yī)學(xué)類專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No: JDYXCX201510)。

謝葉青(1994-)，女，吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院2012級臨床醫(yī)學(xué)本科。

李春艷(1965-)，女，教授，研究方向：天然藥物藥理。

R285.5

A

1001-9677(2016)02-0054-03