酶底物法和多管發酵法檢測水中的總大腸菌群的比較研究

蔣玲，李雪大英縣疾病預防控制中心，四川大英　629300

酶底物法和多管發酵法檢測水中的總大腸菌群的比較研究

蔣玲，李雪
大英縣疾病預防控制中心，四川大英629300

目的 比較酶底物法和多管發酵法對飲用水中的總大腸菌群檢測結果的一致性。方法 使用酶底物法和多管發酵法對指定水樣進行檢測，觀察結果。結果 兩種方法的檢測結果有一致性，兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。結論酶底物法可替代多管發酵法用于評價水質微生物。

大腸菌群；酶底物法；多管發酵法

［Abstract］Objective To compare the consistency of test results of enzyme substrate technique and multi-tube zymolytic method for total coliform group in water.Methods The appointed water sample was detected by the enzyme substrate technique and multi-tube zymolytic method，and the results were observed.Results The test results of the two methods were consistent，and the difference between the two groups had no obvious significance，P＞0.05.Conclusion The enzyme substrate technique can replace the multi-tube zymolytic method to evaluate the water quality and microorganism.

［Key words］Coli group；Enzyme substrate technique；Multi-tube zymolytic method

有資料表明：酶底物法試劑盒彌補了多管發酵法的不足，是現代微生物快速檢測的發展方向，超過90%以上的美國國家實驗室都使用此方法［1］。目前，國內越來越多的實驗室采用酶底物法用于水質大腸菌群的檢測，但總體規模還不大，還未被絕大多數檢測機構所采用；特別是基層實驗室因條件受限，采用酶底物法的比例更少。作者所處的屬于基層實驗室，我們借助較為簡易的基層條件，分別使用酶底物法和多管發酵法對飲用水中的總大腸菌群進行檢測，分析發現兩種方法的檢測結果有高度的一致性。現總結報告如下。

1　材料與方法

1.1樣品

大英縣農村飲用水22份。

1.2試劑

酶底物法由株洲鴻潤檢測技術有限公司提供的總大腸菌群-大腸埃希氏菌測定試劑盒，十管法，批號為20150416。多管發酵法的乳糖培養基由杭州濱和微生物試劑有限公司提供，批號為20150822，EC肉湯由北京奧博星生物技術有限責任公司提供，批號為20141222，伊紅美藍瓊脂由北京奧博星生物技術有限責任公司提供，批號為20141222。

1.3原理

酶底物法是利用大腸菌群可產生β-半乳糖苷酶，該酶能分解試劑盒中底物鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黃色的鄰-硝基酚，使培養基呈現顏色變化，顏色會從無色變成黃色，指示有大腸菌群的存在；而大腸埃希氏菌可產生β-葡萄糖醛酸酶，而β-葡萄糖醛酸酶能對試劑中的4-甲基傘形酮葡糖苷酸 （MUG）成份進行代謝，使其產生熒光，可在紫外燈下進行鑒別。多管發酵法是根據大腸菌群能發酵乳糖，產酸產氣及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢呈桿狀等有關特性的菌群組。

1.4方法

每份水樣分成兩份接種以下兩種方法，根據污染程度進行稀釋。

1.4.1酶底物法采用十管法，直接將水樣100 mL加入含有“科立德”酶底物試劑的無菌瓶中，蓋上瓶蓋，顛倒混勻，使酶底物試劑充分溶解，加樣：使用10 mL無菌刻度吸管吸取上述處理好的水樣10 mL加入到試劑盒的方格中，共十格，蓋上蓋子（36±1）℃，培養24 h后進行判讀，如果結果可疑，可延長培養時間到28 h進行結果判讀，查MPN檢索表報告水樣中的MPN值。

1.4.2多管發酵法應先接種水樣到乳糖蛋白胨培養基，于（36±1）℃培養箱內培養（24±1）h，如所有培養管均不產氣，則可報告為總大腸菌群陰性；如有產酸產氣者，則需要轉種于伊紅美蘭平板，對可疑菌落進行革蘭氏染色、鏡檢和證實實驗。根據證實為總大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表報告水樣中的MPN值［2］。

1.5統計方法

按假設檢驗分析整理統計數據。

2　結果

采用酶底物法和多管發酵法測定水樣中的總大腸菌群的結果詳見下表。

表1　酶底物法和多管發酵法測定水樣中的總大腸菌群結果匯總

通過多管法和酶底物法對22份水樣檢查結果進行比較，對于同一受試對象分別接受2種不同處理方法采用配對t檢驗分析，計算結果：則t=1.640，P＞0.05，兩者差異無統計學意義。

3　討論

管發酵法（GB/T5750-2006）。在目前生活飲用水檢測工作中絕大多數的還采用經典的。究其原因是多管發酵法穩定性好，結果容易判斷，物資成本低。但從本組實驗過程中不難發現，多管發酵法很多是使用的半成品培養基，經實驗室自行配制后再用于樣品的檢測，要經過一系列準備工作才能用于檢測，任何一個環節的誤差都會給檢測結果帶來影響。如：原材料的質量，試劑稱量的準確性和高壓消毒的參數等諸多因素均會對最終結果造成影響。在實驗過程中還需要轉種，驗證試驗，實驗步驟較為繁瑣，程序越多引入的誤差可能性越大，結果的可靠性也就越小；加之許多實驗室沒有條件按照國標用質控菌株對培養基進行性能評價實驗，導致產品質量的最后把關環節存在一定風險。這就將一些不確定性因素引入到了檢測過程中，難以保證檢測結果的準確性。檢測時間相對較長，需要2～5 d，更不能對水質的衛生狀況做出快速評價也是制約工作的缺陷。

酶底物法因技術要求高、檢測費用高等原因致該法應用少。作者通過實踐證實具有人力成本較低，步驟簡便，結果產生快，容易判斷，穩定性也好等優點。試劑盒是在全程質量控制下，按照國標要求配制，消毒并用質控菌株進行性能評價實驗；其操作方便無需確證實驗，此法還可監測大腸埃希氏菌，該菌更有病原學意義；酶底物法穩定，無二次污染，檢測時間較短，18～24 h即可出結果，判斷出大腸菌群和大腸埃希氏菌的MPN值；試劑盒占空間體積較小，受影響因素小，又特別適合大批量和應急檢測的需求。值得推廣應用。

該組對照實驗表明，相對于多管發酵法，酶底物法用于測定水樣中的總大腸菌群具有高度的一致性 （P＞0.05），兩者差異無統計學意義。有實驗者發現酶底物法可以同時檢測總大腸菌群和大腸埃希氏菌。大量研究資料證實：大腸埃希氏菌與腸道傳染病（如腹瀉），消化系統疾病（如胃潰瘍）等有密切的關系［3-4］，因此監測水中含大腸埃希氏菌的多少更有利于說明水質的安全狀況。近年來，我國《生活飲用水衛生標準》與世界接軌，已經增加大腸埃希氏菌的檢測作為評價飲用水水質的指標。通過檢索表的對比可發現由于多管發酵法每100 mL水樣中最低檢出限為2個大腸菌群，而酶底物法每100 mL水樣中最低檢出限為1個大腸菌群，酶底物法在腸桿菌屬的檢出靈敏度上顯著高于多管發酵法，顯然酶底物法更適合大腸菌群較低的水樣；而在埃希氏菌屬的檢出靈敏度基本一致［5－7］。

4　結語

通過以上實驗證明：酶底法和多管發酵法對生活飲用水中總大腸菌群的檢測結果具有一致性，這和孫宗科，趙春霞等的研究結果相同［6-7］。隨著社會發展對檢測結果的快速準確要求，國家對實驗室的投入及實驗室的自身發展，加之國產酶底物試劑的質量逐步優化，與進口試劑等效［8］，檢測成本也將不斷降低，酶底物法對大腸菌群的檢測是個必然趨勢。由于基層實驗室的實驗人員的配備不夠，節省人力成本，步驟簡便的酶底物法特別適合在基層實驗室推廣應用。

［1］Yakub GP，Castric DA，Stadterman-Knauer KL，et al.Evaluation of coliert and enterolert defined substrate methodology for wastewater application［J］.Water Environ Res，2002，74（2）：131-135.

［2］衛生部.GB/T5750.12-2006生活飲用水標準檢驗方法［D］.微生物指標，北京：中國標準出版社，2006.

［3］USEPA.Standard methods for the examination of water and wastewater 20th edition［M］.

［4］USEPA.Ambient Water Quality Criteria for Bacteria.［S］.1986.

［5］王晉宇，趙旭坤，郭志宇，等.酶底物法與多管發酵法檢測總大腸菌群差異分析 ［J］.中國給排水，2012，28（20）：139-141.

［6］孫宗科，丁培，薛金榮，等.水中大腸菌群快速檢測方法-酶底物與多管發酵法的比較［J］.衛生研究，2006，35（4）：497-498.

［7］趙春霞，張哲海，歷以強，等.酶底物法與多管發酵法和紙片法監測環境水樣大腸菌群的比較［J］.環境監測管理與技術，2009，21（2）：63-64.

［8］陳艷宏，馬健，權玉玲.2種試劑的酶底物法和多管發酵法檢測水中總大腸菌群的比較研究［J］.中國衛生檢驗雜質，2014，24（22）：3257-3261.

Comparative Research on Enzyme Substrate Technique and Multi-tube Zymolytic Method in Detecting Total Coliform Group in Water

JIANG Ling，LI Xue
Center for Disease Control and Prevention of Daying，Daying，Sichuan Province，629300 China

R19

A

1672-5654（2016）06（c）-0120-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.18.120

蔣玲（1979.4-），女，四川遂寧人，本科，主管檢驗師，主要從事微生物檢驗工作。

（2016-03-27）