脂肪干細胞在皮膚組織工程中的研究應用進展

肖永強　夏照帆

[摘要]組織工程皮膚作為一種皮膚組織替代物，主要用于覆蓋和修復損傷缺損的皮膚組織，以改善其形態和功能。其中，種子細胞、支架材料及細胞因子是皮膚組織工程研究的三要素。脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有來源豐富、取材方便、低免疫原性、易擴增等優點，是皮膚組織工程較為理想的種子細胞。本文就ADSCs在組織工程皮膚中，包括創面修復、抑制瘢痕增生等的相關應用研究進展及前景進行綜述。

[關鍵詞]脂肪干細胞；皮膚組織工程；種子細胞；修復

[中圖分類號]R644 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）06-0030-04

皮膚作為人體最大的組織器官，覆于體表，起到維持機體內環境穩定、阻止外界有害物質入侵等十分重要的作用。臨床上，自體皮源的缺乏常致大面積燒傷和嚴重創傷患者創面難以及時修復，嚴重影響機體的形態和功能，甚至危及到患者生命。近年來，隨著組織工程技術及有關生命科學的不斷發展而興起的組織工程皮膚替代物，不僅能夠及時覆蓋創面，減少體內水分及電解質的丟失，維護內環境的穩定，而且還能夠減少創面愈合遠期瘢痕的增生，改善創面的外觀和患者的身心健康。因此，組織工程化皮膚具有廣闊而深遠的臨床應用前景。

種子細胞、支架材料及細胞因子是皮膚組織工程研究的三要素。近年來，有可能作為種子細胞的干細胞擁有良好的多分化潛能及細胞因子分泌功能，己越來越被研究者所重視。干細胞的主要來源有胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞和脂肪干細胞等，但因胚胎干細胞有一定的免疫原性、涉及一定的倫理學問題，骨髓干細胞（bolle marrow stem cells，BMSCs）來源少、取材時創傷大，極大地限制了它們的臨床應用，脂肪干細胞（adiposed derived stem cell，ADSCs）具有來源豐富、取材方便、低免疫原性、易擴增等優點，成為目前皮膚組織工程較為理想的種子細胞之一。本文就ADSCs在組織工程皮膚中的相關應用研究進展及前景進行綜述。

1.ADSCs的分離培養及生物學特性

1.1ADSCs的分離純化：ADSCs主要來源于人體脂肪組織，其提取及培養步驟相對較多，在分離的基礎上結合相應的純化方法，便能夠得到純度相對較高的脂肪干細胞。

ADSCs分離方法主要沿用了問充質干細胞的分離流程，包括酶消化法及非酶促分離法兩大類。酶消化法的主要原理是通過膠原酶消化細胞間的膠原組織，使細胞相互分離，再通過過濾、洗滌和離心等步驟分離獲得脂肪干細胞，分離速度較快，缺點是膠原酶較為昂貴，而且在酶的種類、所需濃度及作用時間上缺乏統一標準，需要靠操作者憑借個人的經驗來判斷。非酶促分離法包括組織塊貼壁法、直接離心法、吸附柱法等其中，貼壁法需要解決的主要問題是組織塊貼壁難，換液時容易漂浮，如果這一問題能夠被有效地解決，其將是一種應用前景十分可觀的分離方法；吸附柱法是利用聚乙烯織物等做成的吸附柱裝置對貼壁細胞的親和力作用而分離脂肪干細胞，雖然價格相對低廉，但需要樣品量較大。上述的各種ADSCs分離方法各有優缺點，尚無統一的標準，因此尋找一種操作簡單、成本低廉的ADSCs分離方法仍是未來ADSCs研究領域的重要內容。

分離后為了得到純度較高的ADSCs，緊接著便是ADSCs純化。目前常用的ADSCs純化方法包括：免疫磁珠分選和密度梯度離心法，由于免疫磁珠分選法涉及到的設備及抗體均比較昂貴，不適合普通的研究機構廣泛應用，而密度梯度離心的方法雖然步驟相對較繁瑣，但成本會低很多，因此其是相對較為理想可行的純化方法。

1.2ADSCs的表面標志物：雖然目前對ADSCs免疫表型的鑒定做了大量工作，但ADSCs的表面標志物繁雜，尚未發現特異性的可用于鑒別的表面標志物。現普遍認為ADSCs表達CD13、CD71、CD73、CD29、CD90、CD105和CD166等表面抗原標志，而不表達CD11、CD19、CD31、CD33、CD38、CD45等。表達CD73、CD105和CD90，不表達CD45，并在體外能夠誘導分化成為脂肪細胞、成骨細胞和成軟骨細胞，是ADSCs作為人類間充質干細胞的最低標準。

1.3ADSCs的多向分化潛能：自2001年首次從人脂肪中成功分離并得以體外培養以來，ADSCs能夠在一定條件下被成功誘導分化為內胚層、中胚層及外胚層的眾多細胞系，如肌肉細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞以及角質細胞、成纖維細胞和內皮細胞等，具有多向分化潛能例如，在一定條件下ADSCs能夠誘導分化為肝細胞樣細胞，不但能夠表達產生白蛋白和甲胎蛋白，還擁有吸收低密度脂蛋白LDL、儲存糖原等類似人類肝臟細胞的功能。而早年Safford等人就分別通過實驗研究證明ADSCs在一定條件下可以誘導分化成為神經元樣細胞。不僅如此，ADSCs還有神經保護作用，移植到周圍神經損傷處的ADSCs可以通過減少小膠質細胞的生成、分泌BDNF等神經營養因子來促進軸突生長起到神經保護作用。此外，在體外增殖許多代的子代脂肪干細胞仍具有完好的表面標志物及較強的分化潛能，表明其作為皮膚組織工程的種子細胞具有巨大的優勢。

2.ADSCs與皮膚組織工程

2.1ADSCs可以作為皮膚組織工程皮膚的種子細胞：ADSCs在臨床上易于大量獲得，而且可以自體移植不涉及相關的倫理問題，作為組織工程的種子細胞近年來越來越受到研究者的青睞，己被廣泛應用到軟骨組織工程、骨組織工程和脂肪組織工程等的研究應用當中。如前所述，ADSCs在體外誘導下，可成功向上皮細胞和角質細胞分化。Derby等將ADSCs組織移植到小鼠真皮層后可成功誘導其分化為表皮干細胞，并表達表皮干細胞細胞標志物p63。將ADSCs種植于人脫細胞真皮上培養，加入表皮生長因子和高濃度的鈣離子后，ADSCs能夠成功分化成為角質形成細胞，并能夠形成類似于正常皮膚組織的復層表皮結構，實現皮膚組織工程中表皮的再生。這些優良特性都是其作為皮膚組織工程種子細胞的堅實基礎。

2.2ADSCs與皮膚組織工程支架材料能夠有機結合：理想的組織工程皮膚支架材料應該有良好的機械性能（主要包括機械強度和伸縮性能）、良好的生物相容性（能夠引導細胞粘附及生長，為種子細胞的生長繁殖提供適宜的空間）和無毒副作用的降解產物等特點。按照其化學性質的不同，組織工程皮膚支架材料主要可分為天然支架材料和合成支架材料，天然支架材料擁有良好的生物相容性，但生物力學性能相對較差，而人工合成支架材料的生物力學性能優于天然支架材料，但往往有一定的細胞毒性，限制其廣泛應用及發展。目前研究較熱的合成支架材料主要是聚焦內酯及聚內酯等聚酯類材料，天然生物支架材料主要是膠原類、殼聚糖類及纖維蛋白類等。

研究表明，眾多的皮膚組織工程支架材料能夠與脂肪干細胞有機結合，引導脂肪干細胞的粘附和增殖，構建的復合皮膚組織局部應用能夠很好的促進創面愈合，減少瘢痕的增生。如利用靜電紡絲技術制備的純聚合材料

聚乳酸聚己內酯PLCL及PLCL/Poloxamer與大鼠脂肪干細胞的相容性良好，在微觀結構上能與細胞外基質較一致，非常適合脂肪干細胞的黏附及增殖，且其柔韌性及機械性好、抗磨損，是廣泛應用于組織工程的支架材料。以3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物poly（3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate）（PHBV）作為真皮支架，能夠更好地為ADSCs提供良好的力學支撐及適當的微環境，保持創面水分的同時，還擁有足夠的機械性能以抑制創面的收縮，7d后ADSCs能夠通過分泌VEGF和bFGF而促進血管再生，28d后移植的PHBV支架完全降解，隨后在PHBV原位生成的真皮擁有更加復雜的膠原結構，并能夠通過減少TGF-B 1和a-SMA和增加TGF-B 3的分泌抑制創面瘢痕的增生。

2.3ADSCs能夠分泌多種細胞因子，促進組織工程皮膚的重建：各類具有活性的生長因子為種子細胞的生長繁殖提供營養物質和調節作用。研究表明，ADSCs擁有強大的分泌能力，能夠分泌血管內皮生長因子、肝細胞生長因子、纖維母細胞生長因子、胎盤生長因子、粒細胞巨噬細胞刺激因子、胰島素樣生長因子、血管生成素等眾多生長因子，這些細胞因子具有調節種子細胞增殖、遷移、分化及蛋白的表達、維持其生物學功能、促進血管生成、調節免疫原性等十分重要的作用，能夠促進組織工程皮膚的重建。

3.ADSCs與創面愈合

3.1ADSCs能夠促進創面愈合：創面修復是一個復雜的過程，涉及到炎癥反應、血管的生成和新生組織的產生和重塑等過程。脂肪源性干細胞能夠將自己和周圍的局部微環境整合到一起，加速創面修復并分化成所需要的細胞，還能通過自分泌及旁分泌的形式分泌EGF、VEGF、vWF、VEGF等眾多細胞因子，刺激血管再生，減輕創面局部炎癥反應，促進周圍的細胞分化增殖等，從而會顯著的促進創面的愈合。

3.2ADSCs能夠減少創面瘢痕的增生：瘢痕增生在創面愈合過程中往往難以避免，病理性瘢痕的形成常常會嚴重影響機體的美觀和功能，使患者心身健康受到影響，嚴重者在臨床防治和康復整形治療上的花費甚至遠遠高于其原發疾病的治療費用。而ADSCs的局部應用能夠通過減少a-SMA和I型膠原的產生，改善膠原的排列等作用，有效的減少創面修復過程中瘢痕的增生。不僅如此，ADSCs的應用還可以軟化皮膚皺紋、通過抑制黑色素合成酶從而抑制黑素細胞的增殖和黑色素的合成、減少色素沉著、達到美白的效果，最大限度的恢復患者創面的外觀和功能，減少患者的心理負擔，有可能是未來創面修復的理想選擇之一。

4.展望

ADSCs作為皮膚組織工程的種子細胞，既不涉及倫理問題，又有著充足的來源，簡單易得，但至今尚未發現一種公認、專一的ADSCs特異性標記物，所以其分離、培養及鑒別尚無統一模式，有待于進一步研究。

雖然組織工程皮膚在燒傷、慢性難愈性創面及先天性皮膚畸形等諸多疾病的治療領域取得了一定的成效，但作為種子細胞ADCSs向多種組織定向分化的機制目前尚不明確，而且擴增的ADSCs是否有癌變傾向也無數據證實，ADSCs作為種子細胞與支架材料、細胞因子相結合的皮膚替代物的長期臨床效果還沒有得到很好的證實，再加上人體皮膚組織本身的復雜性，以及對人類皮膚自身結構研究的不透徹性，因此，ADSCs與組織工程化皮膚的研究，要想完全達到人體正常皮膚功能狀態仍有很長的路要走。