航海條件下血液不同保存方法對紅細胞表達黏附分子的影響

劉書遜，唐大海，賀嘉蕾，韓利華，劉曼嬌，吳　江

?

·臨床醫學·

·論著·

航海條件下血液不同保存方法對紅細胞表達黏附分子的影響

劉書遜，唐大海，賀嘉蕾，韓利華，劉曼嬌，吳江

目的探討航海過程中血袋擺放方式對紅細胞表達黏附分子的影響。方法于出航訓練當日，采集4位健康志愿者全血，按常規方式制備紅細胞懸液，每份均分成4份，1份作為對照組保存在醫院輸血科冰箱，采用直立貼放方式，另3份作為實驗組分別采用平鋪碼放、直立貼放、垂掛固定3種方式同置于艦載儲血冰箱。訓練結束后，立即檢測送至實驗室檢測紅細胞黏附分子CD58, CD44, CD47的表達。結果與陸地保存紅細胞比較，航海條件下艦載冰箱直立貼放保存的全血中紅細胞表達CD44和CD47的水平顯著升高，平鋪碼放保存的紅細胞表達CD58的水平顯著降低。結論從表達黏附分子角度，航海條件下，紅細胞適宜采用直立貼放方式保存于冰箱中。

船載運輸；血液保存；紅細胞；黏附分子

找到適合于艦船上保存血液的條件是航海醫學面臨的一個新課題。航海時受波涌影響，放置于艦載冰箱中的全血實際上處于一種緩慢的、規律的振動狀態，因此存放方式對紅細胞的影響可能會不同于陸地上血庫中的紅細胞。除了作為循環中唯一的供氧者，紅細胞通過供氧保證各組織臟器的正常生理功能，還作為一類免疫細胞與機體中的其他免疫細胞、血管內皮細胞等相互作用[1-2]。已有的研究顯示，紅細胞通過表達多種黏附分子，與T細胞、單核/巨噬細胞、血管內皮細胞黏附并相互影響各自的功能[3-4]。筆者的另一項研究顯示，艦載冰箱中采用平放方式對紅細胞的滲透脆性和免疫黏附功能的影響較大，在本研究中筆者主要從紅細胞表達黏附分子(CD44，CD47，CD58)的角度探討不同艦載擺放方式對紅細胞的影響。

1　材料與方法

1.1血液采集與保存根據《獻血者健康檢查要求》(GB 18467-2011)，于出海訓練前1 d、采集4名健康志愿者全血各200 ml(分別編號為a～d)，ACD抗凝。按常規方法制備紅細胞懸液各160 ml，密閉條件下平均分裝置4份血袋中，依次編號1～4。制備日，按常規血液儲存條件垂直貼放于輸血科專用儲血冰箱內，各組1號作為陸地冰箱儲存對照組，其余于出發當日冷鏈轉送至出海訓練船只的專用冰箱中，各組2號采用垂直固定懸掛方式、3號采用直立貼合方式、4號采用平鋪碼放方式。任務結束當日，同樣冷鏈轉送至輸血科實驗室送檢。

1.2儀器與試劑FACS LSRII流式細胞儀購自美國BD公司。熒光素偶聯的鼠抗人CD44-PE、CD47-PE、CD58-FITC單克隆抗體和同型對照抗體購自美國B.D. Pharmingen公司。

1.3航海條件2012年6月5-25日，任務船只隨“神舟九號”海上應急救援保障編隊出航。航行21 d，航程5 000 n mile。期間，船只搖擺5度14 d，8度、9度各2 d，10度3 d，總計搖擺度5～10度，中位5度。海區浪高1.5 m 7 d，2 m 1 d，2～2.5 m 1 d，2.5 m 6 d，2.5～3 m 2 d，3 m及以上4 d，總計浪高在1.5～3 m，中位2.5 m。海況4～5級，其中5級5 d，4級16 d，中位4級。

1.4流式細胞術(fluorescence activating cell sorter,FACS)各組細胞先用預冷PBS配制1×106/ml的紅細胞懸液，分別加入終濃度為1 μg/ml熒光素偶聯的抗黏附分子抗體(CD58, CD44, CD47)或同型對照抗體(購自B.D.Pharmingen)，混勻后4℃放置15 min，再用PBS洗滌3次，重懸于300 μl PBS中，上機檢測(機型：B.D.FACS LSRII)，FACSDiva軟件分析。黏附分子的表達以相對熒光強度表示，計算公式為：抗黏附分子抗體標記的幾何平均熒光強度(geometric fluorescence intensity,GMI)/同型對照抗體標記樣品的GMI。

1.5統計學處理以相對熒光強度和每組均數±標準差(x±s)表示，采用配對樣本t檢驗，以GraphPad Prism軟件分析作圖，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1船載冰箱3種存放方式保存紅細胞表達CD44的水平與留存輸血科冰箱中的紅細胞比較，船載冰箱采用直立貼合放置方式(G2)保存的紅細胞表達CD44(P=0.036)明顯上調；采用垂直懸掛(G1)和平鋪碼放方式(G3)保存的紅細胞膜表面CD44的表達沒有發生顯著改變。見圖1。

注：A為各組中代表性CD44的表達(點圖)；B為各組所有樣本CD44表達的相對熒光強度，紅色顯示平均值±標準誤；G1～3為3種存放方式；aP<0.05圖1　不同船載冰箱存放方式對紅細胞表達CD44水平的影響

2.2船載冰箱3種存放方式保存紅細胞表達CD47的水平與留存輸血科冰箱中的紅細胞比較，船載冰箱采用直立貼合放置方式(G2)保存的紅細胞表達CD47(P=0.001)明顯上調；采用垂直懸掛(G1)和平鋪碼放方式(G3)保存的紅細胞膜表面CD47的表達沒有發生顯著改變。見圖2。

注：A為各組中代表性CD47的表達(點圖)；B為各組所有樣本CD47表達的相對熒光強度，紅色顯示平均值±標準誤；G1～3為3種存放方式；aP<0.01圖2　不同船載冰箱存放方式對紅細胞表達CD47水平的影響

2.3船載冰箱3種存放方式保存紅細胞表達CD58的水平與留存輸血科冰箱中的紅細胞比較，船載冰箱采用平鋪碼放方式(G3)直立貼合放置方式(G2)保存的紅細胞表達CD58(P=0.001)發生明顯下調；采用垂直懸掛(G1)和直立貼合放置方式(G2)保存的紅細胞膜表面CD58的表達沒有發生顯著改變。見圖3。

注：A為各組中代表性CD58的表達(點圖)；B為各組所有樣本CD58表達的相對熒光強度，紅色顯示平均值±標準誤；G1～3為3種存放方式；aP<0.01圖3　不同船載冰箱存放方式對紅細胞表達CD58水平的影響

3　討論

紅細胞膜表面黏附分子，如CD44，CD47和CD58等的表達水平在一定程度上反映其衰老程度。有研究表明，儲存紅細胞表達的CD44分子，在28 d后，與年輕紅細胞相比會發生顯著性的下調[5]。在不含有白細胞的儲存血中，紅細胞表面的CD47和CD58在保存期不會發生明顯的改變，而在含有白細胞的儲存血液中，CD47和CD58的表達會迅速降低[5]。因此，通過儲存紅細胞表面黏附分子的表達可以判斷紅細胞的衰老情況，從而為研究儲存血液的方式提供一種檢測手段。

衰老紅細胞更容易被脾臟中的單核巨噬細胞吞噬清除，紅細胞膜表面的CD47分子的表達水平調控著紅細胞對巨噬細胞吞噬的反應性。CD47能夠結合巨噬細胞表面的信號調控蛋白α(SIRPα)，SIRPα是一種負向調控分子，其所轉導的信號抑制巨噬細胞的吞噬功能[6]。因此，低表達CD47的衰老紅細胞，因不能夠結合更多的SIRPα分子而使負向調控信號的強度較弱而更容易被巨噬細胞吞噬。艦載冰箱直立貼放方式保存的紅細胞在CD47分子的表達上明顯的高于陸地保存的紅細胞和其他兩種保存方式保存的紅細胞，說明這種方式更能夠延緩紅細胞的衰老。

CD44作為一種膜糖蛋白，表達廣泛，主要參與細胞-細胞相互作用，細胞黏附以及遷移等過程。CD44已知的大多數配體為細胞外基質，包括透明質酸、骨橋蛋白、膠原配體，此外還有基質金屬蛋白酶。有研究發現，紅細胞膜表面CD44能夠與中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的未知配體相互作用，進一步激活中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞與內皮的黏附[7]。這種效應提示，在炎癥或者其他病理條件

下，紅細胞通過與這些細胞的相互作用促進有可能促進這些炎性細胞遷出血管外或者形成血栓。衰老紅細胞和長期保存的紅細胞的CD44表達下調，表明保存紅細胞在體內的這種生理功能降低。因此，艦載冰箱直立貼放方式保存的紅細胞在CD44分子的表達上明顯的高于陸地保存的紅細胞和其他兩種保存方式保存的紅細胞，說明這種方式更能夠延緩紅細胞的衰老或者更接近生理條件下的紅細胞。

此外，船在冰箱中平鋪碼放保存的紅細胞CD58的表達顯著低于陸地保存紅細胞和其他兩種方式，說明這種方式不適合在航行過程中保存紅細胞。另一份通過檢測紅細胞滲透脆性和黏附功能的研究，也證實了這種方式的缺陷。鑒于垂直懸掛固定方式保存的紅細胞表達CD47的水平低于直立貼放方式，因此艦載冰箱直立方式更適于航海時的輸血貯存需要。

[1]Fens MH, van Wijk R, Andringa G, et al. A role for activated endothelial cells in red blood cell clearance: implications for vasopathology[J]. Haematologica, 2012, 97: 500-508.

[2]Danesh A, Inglis HC, Jackman RP, et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro[J].Blood, 2014,123:687-696.

[3]Anniss AM, Sparrow RL. Variable adhesion of different red blood cell products to activated vascular endothelium under flow conditions [J]. Am J Hematol, 2007, 82: 439-445.

[4]Trinh-Trang-Tan MM, Vilela-Lamego C, Picot J, et al. Intercellular adhesion molecule-4 and CD36 are implicated in the abnormal adhesiveness of sickle cell SAD mouse erythrocytes to endothelium [J].Haematologica, 2010, 95:730-737.

[5]Khandelwal S, van Rooijen N, Saxena RK. Reduced expression of CD47 during murine red blood cell (RBC) senescence and its role in RBC clearance from the circulation[J]. Transfusion, 2007, 47:1725-1732.

[6]Sparrow RL, Healey G, Patton KA, et al. Red blood cell age determines the impact of storage and leukocyte burden on cell adhesion molecules, glycophorin A and the release of annexin V [J]. Transfus Apher Sci, 2006, 34:15-23.

[7]Zennadi R, Chien A, Xu K,et al. Sickle red cells induce adhesion of lymphocytes and monocytes to endothelium[J]. Blood, 2008, 112: 3474-3483.

(本文編輯：甘輝亮)

The expression of adherent molecules in the preservation of human red blood cells during deployment at sea

LiuShuxun,TangDahai,HeJialei,HanLihua,LiuManjiao,WuJiang

(DepartmentofImmunology&NationalKeyLaboratoryofMedicalImmunology,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

ObjectiveTo investigate the effect of blood-bag placement mode in the refrigerator on the expression of adherent molecules in the preservation of human erythrocytes onboard the ship.Methods On the first day of deployment to sea, 4 blood samples were collected from 4 healthy volunteers. Erythrocyte suspension was equally aliquoted into four portions, one as the control group was placed vertically in the refrigerator of the hospital and the other three as the experiment group were preserved in the same refrigerator onboard the ship in 3 different placement modes (the layer-upon-layer mode, the upright mode and the vertical suspension mode). After completion of the training, the preserved samples were immediately sent to the laboratory for the detection of the expressions of CD47, CD58, and CD44.ResultsThe expression levels of CD44 and CD47 in the erythrocytes of whole blood placed on the shipboard refrigerator were significantly higher, as compared with those of the control group in the hospital. The expression levels of CD58 in the erythrocytes placed in the layer-upon-layer mode decreased significantly.ConclusionFrom the aspect of the expression of erythrocyte, the upright placement mode was most suitable for the preservation of blood in the shipboard refrigerator.

Shipboard blood transport; Blood preservation; Erythrocyte; Adherent molecule

國家自然科學基金(81172787，31470858)

單位]200433上海，第二軍醫大學免疫學教研室(劉書遜)；解放軍第四一一醫院檢驗科(唐大海、賀嘉蕾、韓利華、劉曼嬌)；上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院輸血科(吳江)

吳江，電子信箱：wujiang@renji.com

R82

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2016.04.016

2015-12-20)