微衛星分子標記技術在遺傳學實驗教學中的應用——科研轉化為實驗教學的實踐和探索

李　潔, 梁前進, 靳　溪, 王紅芳

(北京師范大學 生命科學學院, 北京　100875)

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微衛星分子標記技術在遺傳學實驗教學中的應用——科研轉化為實驗教學的實踐和探索

李潔, 梁前進, 靳溪, 王紅芳

(北京師范大學 生命科學學院, 北京100875)

在遺傳學實驗教學中,遺傳分子標記實驗的引入有助于學生深入理解該技術的研究方法和應用價值。利用微衛星分子標記技術分析油松種子葉綠體DNA的遺傳信息,確定校園內油松種子的花粉來源、擴散關系及受環境變化的影響。教學實踐表明,科研成果轉化為教學實驗,不僅能為實驗教學提供新的材料和方法,且有益于學生科研思維能力、創新精神以及實踐能力的培育和訓練。

遺傳學實驗； 微衛星分子標記； 親本分析

遺傳學實驗是一門經典的實驗課程。隨著遺傳學的快速發展,經典遺傳學、分子遺傳學以及群體遺傳學不再涇渭分明,而是相互滲透、相互補充、相互融合。然而,針對本科生的遺傳學實驗教學卻跟不上遺傳學發展的腳步。傳統遺傳學實驗教學內容仍以經典的驗證性、示范性實驗為主,綜合性、設計性實驗所占比例較少,難以達到對學生科研思維、實驗技能和自主創新等方面的訓練和提高[1-3]。因此,遺傳學實驗需要結合自身科研背景和可行性的基礎上推陳出新,設計一些有益于培養學生科研思維能力、提高學生實驗操作技能以及調動學生實驗積極性、主動性和創造性的綜合性實驗。

我們通過幾年的嘗試,將微衛星分子標記技術結合油松親本分析轉化為遺傳學實驗教學內容,取得了不錯的教學效果。本實驗的研究對象選擇校園廣泛種植的油松群體,通過第二代分子標記技術——微衛星分子標記和親本分析的方法來確定校園油松子代的花粉來源和擴散關系。我們將該實驗簡稱為油松種子“找爸爸”。本實驗在介紹微衛星分子標記技術的基礎上引入了一些群體遺傳學、生態學的概念和方法,在知識體系和內容設計上考慮了學生綜合運用知識分析、解決和探索科學問題的各個方面。

1　實驗原理

微衛星DNA又稱簡單重復序列(simple sequence repeats,SSR),是常用的DNA分子的標記,廣泛分布于基因組的不同區域。微衛星標記指基因組中由1～6個堿基重復多次構成的一段DNA,長度可達150 bp左右,為共顯性標記[4-5]。微衛星DNA在復制過程中可能出現“滑動錯配”,從而導致微衛星DNA的長度發生變化[5],使得這一分子標記具有相對較高的突變速率[6],在群體中呈現較高的多態性。此外,微衛星DNA分子標記技術也具有簡便、快捷、穩定性好和等位基因多態性高等特點[4]。因此,通過比較同一物種不同個體微衛星DNA的長度變異,可以有效判斷不同個體之間的親緣關系以及親子代關系。

油松(PinustabulaeformisCarr),為裸子植物門松科松屬常綠喬木,在華北地區較為常見。油松雌雄同株,花粉具囊,風媒擴散。授粉期一般在4月中旬至6月,授粉后的種子于次年8月發育成熟,但是其球果失水開裂則一般須至9月—10月[7-8]。采用油松種子作為微衛星分子標記和父本分析的實驗材料具有諸多優點。比如:采樣方便,樣本量可大可小；松屬葉綠體為父本遺傳且為單倍體,利于父本分析[9-10]；松屬植物細胞的核和葉綠體DNA的微衛星引物豐富；可以探討環境變化對遺傳多樣性的影響等。

油松的種子是由胚、胚乳和種皮組成的,代表3個不同的世代。其中胚來自受精卵,是新的孢子體世代(2n)；胚乳來自于配子體(n),是配子體世代；種皮來自珠被,是老的孢子體世代(2n)[11]。油松胚的葉綠體基因組為父本遺傳,且葉綠體基因組為單倍體；胚乳的葉綠體基因組和種子母本的葉綠體基因組的遺傳信息一致,且也是單倍體。因此,本實驗針對油松種子的葉綠體基因組設計微衛星分子標記實驗,結合親本分析來探討油松種子的父本來源及花粉擴散情況。實驗內容總體設計為3個部分:首先分別提取油松種子胚、胚乳的總DNA；然后獲得多個針對葉綠體DNA的微衛星DNA序列；最后通過父本分析確定油松子代的父本來源,并分析油松花粉擴散特點以及它受景觀結構及其變化的影響。學生通過實驗不僅可以掌握微衛星分子標記技術和油松親本分析的方法,還可以探索景觀破碎化對基因流及其遺傳多樣性的影響。

2　實驗材料與方法

2.1實驗材料的收集

每年8月下旬在校園收集油松球果并記錄油松個體的空間位置,將球果放于信封袋中置于陽光下曝曬1周左右,取出種子備用(見圖1)。

圖1　松樹的雌球果、種子以及種子的胚和胚乳

2.2油松種子胚、胚乳DNA的提取

(1) 油松種子胚、胚乳的分離和破碎。干燥后的油松種子呈不規則橢圓型,表面覆蓋著褐色的種皮。種皮包裹在胚乳表面；胚為圓柱形(圖1(c)左),位于種子的中心部位,外部由胚乳(圖1(c)中的中和右)包裹，剝離種子的種皮后暴露胚乳組織,圖1(c)已將胚、胚乳分離。將分離的胚、胚乳分別裝入含有石英砂和鋼珠的Fastprep管中(學生前次課準備)。將Fastprep管放置于Fastprep組織破碎儀中(型號:Fastprep-24homogenizer)以5級速度破碎樣品20 s,該步驟也可以用液氮研磨代替。

(2) 油松種子胚、胚乳DNA的提取。油松種子胚、胚乳DNA的提取可以采用傳統的CTAB總DNA提取法。本實驗因為時間限制,使用的是天根的植物全基因組DNA提取試劑盒,具體方法見試劑盒說明書(貨號:K0013)。

(3) 瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質量。配制0.8%的瓊脂糖凝膠,恒壓100 V,電泳0.5 h；凝膠成像系統(紫外燈)觀察電泳結果并拍照。

2.3PCR擴增葉綠體基因組SSR序列

本實驗參照日本黑松葉綠體基因組序列中的微衛星DNA序列及側翼序列設計引物[12],利用PCR技術擴增微衛星DNA序列,瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

(1) 6條引物序列及熒光標記情況見表1。

(2) 在1.5 mL離心管中配制PCR反應體系混合液。需注意:各小組2顆種子,6對熒光引物,可先按30個PCR反應所需量配制除引物和DNA模板以外的混合液,瞬時離心混勻,將混合液分裝到24個反應管中,每管17 μL；向每管分別添加2 μL DNA模板,上下游引物各0.5 μL；瞬時離心后將反應管放到PCR儀上。PCR反應條件:94℃變性5 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火30 s,72延伸1 min,共30個循環；最后在72 ℃下延伸10 min。熒光易淬滅,須盡量縮短熒光引物和PCR產物的見光時間。

(3) 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。配制1%的瓊脂糖凝膠凝膠,恒壓100 V,電泳0.5 h；凝膠成像系統(紫外燈)觀察電泳結果并拍照。

表1　6對SSR引物的熒光標記、長度及序列

2.4毛細管電泳檢測含有熒光標記的SSR的長度

將電泳檢測后的PCR樣品送測序公司檢測SSR的序列長度。為節省測序費用,本實驗在設計熒光引物時根據微衛星的序列長度給上游引物標記不同顏色的熒光(見表1),因此測序時可以將不同長度和熒光顏色的微衛星序列混合測序。在本實驗中設計為Pt2、Pt6、Pt20擴增的微衛星DNA混合為一組測序；Pt9、Pt10、Pt4擴增的微衛星DNA混合為另一組測序。

3　實驗結果分析

3.1瓊脂糖凝膠電泳結果

油松種子胚、胚乳的總DNA電泳檢測結果見圖2。圖3為瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。幾年的教學實踐表明,基本上所有實驗小組都能成功提取材料的總DNA并擴增相應的SSR序列。

圖2　凝膠電泳檢測油松種子胚、胚乳的總DNA電泳檢測結果

圖3　瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物

3.2毛細管電泳檢測含有熒光標記的SSR的長度

實驗采用GeneMapper v4.0軟件分析測序公司返回的測序結果,通過bin法取整得到微衛星的等位基因[13](該部分由教師介紹原理和演示軟件分析),分析結果以SSR的長度表示。以Pt2引物為例,測序結果經GeneMapper v4.0軟件分析所得的數據見圖4。從圖4可以看出,SSR等位基因以毛細管電泳的估測長度表示,不同的等位基因具有不同的長度。這種測序技術可以區分SSR一個堿基的長度差異。如圖4所示,Pt2引物在不同樣本中擴增的SSR測序可得到3個不同的等位基因,它們的長度分別為147、148、149 bp。本實驗其他引物擴增的SSR的分析方法和Pt2引物類似,只是不同SSR序列在群體中等位基因的長度和數目不同。學生在教師的協助下完成測序結果分析,課后通過親本分析,確定種子花粉來源。

圖4　GeneMapper v4.0軟件分析Pt2引物擴增不同樣本所得產物的測序結果(圖中所示Pt2引物擴增的SSR具有3個等位基因,長度分別為:147、148、149 bp)

3.3通過親本分析判斷油松種子的父本來源

親本分析主要基于油松種子的遺傳特征而進行。本實驗的親本分析主要基于油松種子中胚的葉綠體為父本遺傳,且葉綠體基因組為單倍體；即通過比較種子胚與其潛在父本在葉綠體基因組上多個位點SSR的一致性來判斷其父本的可能來源。通過分析測序結果,每顆油松種子的胚、胚乳都可得到6條微衛星DNA的長度數值。先將該種子胚、胚乳分別得到的SSR的長度值進行比較,若這6條SSR的長度數值全部一致,或至少有5條SSR的長度值一致,可認為該種子是自交產生。反之,學生則需要根據教師提供的校園油松潛在父本的遺傳信息庫來尋找該種子的父本,確定花粉來源。確定父本的原則也是要求種子和潛在父本有5條及以上SSR的長度值一致。如果所選種子在提供的潛在父本庫里找不到匹配的可能父本,則可認為該種子的父本可能來源于我們設計的種群之外。

4　教學意義與總結

4.1積累教學資源,教學與科研有機結合

將復雜的科研成果的核心內容轉化成學生簡單易懂、容易操作的實驗是我們實驗教學改革的內容之一,也要求教師積累一定的教學資源,精心設計實驗內容[4]。本實驗之所以能順利開展,得益于教師和助教之前獲得了校園各處油松個體的遺傳信息,建立了校園油松個體的遺傳信息庫。這個信息庫就是為學生提供的油松潛在父本的遺傳信息庫。學生根據提供的潛在父本遺傳信息庫很容易分析油松種子的花粉來源、擴散的特點以及它受景觀結構及其變化的影響(見圖5)。此外,為保證實驗的準確性,針對油松種子葉綠體基因組的SSR位點,設計了6對具有多態的熒光引物。通過比較這6對引物擴增的SSR序列可以判斷油松種子父本的可能來源。這種判斷的誤差取決于SSR引物的數量以及多態性。經過教師多年的科研實驗表明,采用的這6對引物基本可以區分20棵不同油松個體的潛在父本,從而可以相對準確地進行油松父本分析,保證學生獲得較為理想的實驗結果。

圖5　校園油松群體的分布以及學生通過親本分析得出油松種子花粉的來源和擴散情況(如圖中所示,7號油松種子的花粉可能來源于6號、8號、11號以及種群之外的松樹個體)

在科研成果轉化為實驗教學的基礎上，將教學與科研有機結合,實現資源共享。教師將自己積累的科研經驗、科研方法引入實驗教學中,并把在科研工作中所獲得的新的信息及時補充到課堂中[14]。學生能夠在科研實驗的支持下學習新的技術、方法和內容,開闊眼界、掌握更多的前沿知識,拓展了實驗教學內容的深度和廣度。教師在課堂指導學生的同時,采集實驗數據,并作進一步的分析和完善,為科研提供基礎實驗材料。一些興趣濃厚的學生課后積極參與到教師的科研項目中,提出具有啟發和參考價值的想法和思路,也為教師科研項目的順利進行添磚加瓦。

4.2注重思維訓練,激發科研興趣

將科研成果轉化為實驗教學內容,使更多具有前瞻性的內容進入課堂,這些知識不僅能激發學生對專業知識的學習熱情,而且有助于學生開闊視野、活躍思維,同時也穩定了學生的專業思想[14-15]。本實驗在訓練學生綜合實驗技能的基礎上,注重科研思維和創新能力的培養。本實驗和經典的驗證型實驗相比更能提高學生學習的主動性和積極性。首先,實驗內容基于“為油松種子找爸爸”,誰都不知道自己手中油松種子的父本來源,而且這個答案具有各種可能。其次,學生在解決這個問題的同時接觸到了其他學科的新知識和方法,豐富了他們的知識體系、提升了他們的實驗興趣,進而也要求他們綜合運用所學的知識來分析解決實驗問題。再次,大部分學生對這種探索型實驗的興趣較高,實驗結果的得出也不是一個直觀的現象觀察,而是需要學生進一步分析探討得出可能的結論。學生經過對實驗原理、內容和結果的理解、分析、挖掘,使得他們站在一個新的高度來看待整個實驗過程,在一定程度上訓練了他們科學思維、獨立思考、創新意識等方面的能力。在最后的小論文中,學生不僅提出了自己對該實驗結果的分析理解,還綜合分析了全班乃至整個年級的實驗結果,推測景觀破碎化對基因流及其遺傳多樣性影響的可能原因。因此,在提高教學水平的基礎上也進一步激發和提升了學生參加科研和進行業余科研活動的積極性。

5　結語

生命科學迅猛發展的今天,對本科實驗教學也提出了更高的要求和挑戰。實驗教學的改革與發展也需

要與時俱進,跟上學科發展的步伐和時代對人才培養的需求。遺傳學實驗教學不僅僅是為了驗證遺傳學的基礎理論和掌握一些實驗技術,更重要的是要提高學生的科學思維能力、研究能力,培養學生的探索精神、創新意識和創新能力[16]。在遺傳學實驗教學中,通過改進教學方式和內容激發學生的學習興趣,能夠有效地培養和提高本科生的科研能力。通過以上嘗試,我們也積累了一定的教學實踐經驗,為課程體系下一步深入改革和提高做好了前期準備。我們會堅定不移地按照人才培養的教學計劃和目標,通過不懈努力和持久開拓,實現遺傳學實驗課程體系的日臻完善。

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Application of microsatellite molecular markers techniques in genetics experimental teaching:Practice and exploration of transforming scientific research into experimental teaching

Li Jie, Liang Qianjin, Jin Xi, Wang Hongfang

(College of Life Sciences,Beijing Normal University,Beijing 100875, China)

The transforming of scientific research into experimental teaching is an important way to improve the quality of undergraduate experimental teaching. During the genetics experimental teaching, the introduction of genetic molecular markers techniques can help students understand the research method and application value of this technology. In the present experiments, the microsatellite molecular markers were applied for analyzing the genetic information of chloroplast DNA from the seed of pinus tabulaeformis. The result can be used to determine the sources of pollen grains and environmental changes that affect pollen diffusion conditions. The teaching practice shows that transforming scientific research into teaching experiments can not only provide new materials and methods for the experimental teaching, but also benefit the students to cultivate and train their scientific thinking ability, innovative spirit and practical ability.

genetics experiment; microsatellite molecular markers; parentage analysis

DOI：10.16791/j.cnki.sjg.2016.01.014

2015- 06- 29修改日期:2015- 07- 21

國家自然科學基金國際合作與交流項目(31210103911)

李潔(1982—)，女(苗族)，湖南綏寧，碩士，在讀博士生，實驗師，研究方向為植物發育分子生物學

E-mail:lj@bnu.edu.cn

王紅芳(1982—)，女，安徽黃山，博士，副教授，研究方向為譜系地理學及景觀遺傳學.

E-mail:wanghf@bnu.edu.cn

Q343-33

A

1002-4956(2016)1- 0053- 05