小果葉下珠花氣味組成及其兩性異型性

黃代紅，陳國平，楊曉飛，李后魂，石福臣

南開大學生命科學學院，天津　300071

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小果葉下珠花氣味組成及其兩性異型性

黃代紅，陳國平，楊曉飛，李后魂，石福臣*

南開大學生命科學學院，天津300071

大戟科(Euphorbiaceae)植物小果葉下珠(Phyllanthusmicrocarpus)由種特異性細蛾科(Gracillariidae)昆蟲頭細蛾(Epicephala)專門為其傳粉，具體包括：頭細蛾在雄花上積極采粉，然后為雌花授粉并在其內產卵等極其不同的傳粉行為。花氣味在維持小果葉下珠與傳粉頭細蛾專性傳粉互利共生關系中起著至關重要的作用。采用動態頂空吸附法分別收集小果葉下珠雌花和雄花氣味，利用氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)聯用技術分析鑒定其成分，并用峰面積歸一法與內標法進行定量，最后通過主成分分析法比較兩者間的差異性。結果表明：(1)小果葉下珠花氣味中共分離出17種化合物，主要以萜類和脂肪族物質為主；順-β-羅勒烯在雌花和雄花中含量均最高，為主要氣味成分；(2)雌花氣味釋放量顯著高于雄花；(3)雌花和雄花之間氣味化學成分存在明顯的差異，即具有兩性異形性。初步推測花氣味出現兩性異形性是植物為適應傳粉頭細蛾極其高度特異的傳粉行為(雄花采粉，雌花傳粉并產卵)而選擇進化的結果。

專性傳粉；互利共生關系；小果葉下珠；頭細蛾；花氣味；兩性異型性

植物與昆蟲之間互利共生關系中最為特化的例子就是植物-種子寄生性傳粉昆蟲專性傳粉互利共生關系[1-5]。在此類傳粉系統中，昆蟲為植物傳粉同時，并在其繁殖器官內產卵[6]。最經典的模式有榕樹-榕小蜂[7-9]和絲蘭-絲蘭蛾系統[2，5]。此外，細蛾科(Gracillariidae)頭細蛾屬(Epicephala)昆蟲與大戟科(Euphorbiaceae)算盤子屬(Glochidion)，葉下珠屬(Phyllanthus)和黑面神屬(Breynia)植物也存在類似的專性傳粉互利共生關系[3，10-12]。

花氣味在植物-昆蟲專性傳粉互利共生體系中具有非常重要的生態功能，它作為宿主植物釋放的一種化學信號，可以強烈地吸引種特異性傳粉者，介導傳粉昆蟲定位到宿主，促使雙方相遇，進而尋求各自所需的報酬[13]。小果葉下珠(Phyllanthusmicrocarpus)為雌雄同株，單性花。在夜晚，由種特異性頭細蛾專門為其傳粉：首先，頭細蛾在雄花上采集花粉，然后為雌花傳粉，之后在授過粉的雌花中產卵。孵化的幼蟲僅消耗一部分種子即可完成發育，剩余的種子可確保宿主能夠繁育后代。這樣雙方之間形成了專性傳粉互利共生關系[10]。然而，小果葉下珠花小且顏色不鮮艷(圖1)，加之頭細蛾一般在夜間活動，進而推測花氣味可能作為一種化學信號，在夜晚來吸引傳粉頭細蛾定位到小果葉下珠植株，是維持小果葉下珠與傳粉頭細蛾之間高度的種特異性所必須的。因此，分析小果葉下珠花氣味的化學組成是非常有必要的。

兩性異型性在動物界普遍存在，主要指兩性間所表現出的差異，包括個體大小、形態以及顏色間的不同，有時甚至包括生理、行為和生活史等方面的差異[14-15]。在被子植物中，雌雄異花植物均由兩性花植物進化而來，將近占被子植物的30%[16]。在雌雄異花的蟲媒植物中，雌花和雄花產生的氣味通常都是均質的，不具有兩性異型性。其主要原因有兩點：(1)雌花和雄花均吸引同一傳粉者，兩性間相似的花氣味可以確保傳粉者攜帶花粉順利完成雄花到雌花的種內轉移，成功完成傳粉[17-19]；(2)在一般的傳粉系統中，傳粉僅僅是一個副產品，傳粉者為植物傳粉同時，主要是從雌花和雄花間所尋求相同的報酬，比如取食花蜜[20]。然而，在大戟科植物-傳粉頭細蛾育幼傳粉系統中發現一種很有趣的現象，傳粉頭細蛾在宿主植物上表現出明顯不同的傳粉行為(報酬)：在雄花上積極采粉，然后為雌花傳粉并在其內產卵[3，10-12]。宿主植物為了確保頭細蛾在其上完成這兩種高度特異且完全不同的傳粉行為，雌花和雄花可能會選擇進化出不同的氣味。因此，推測小果葉下珠雌花和雄花的氣味之間可能存在差異，即兩性異型性。

基于以上假設，本研究利用動態頂空吸附法分別收集小果葉下珠雌花和雄花氣味揮發物，運用GC-MS技術分析吸引傳粉頭細蛾的特異性化學信號的組成，并且運用主成分分析法比較雌花和雄花的氣味之間化學成分的差異性，來初步探討維持小果葉下珠和傳粉頭細蛾專性傳粉互利共生關系的化學生態機制。

1　材料和方法

1.1實驗材料

2013年3月底至4月初于廣西省憑祥市夏石鎮梢平林場附近公路兩旁的小果葉下珠植株 (圖1)上分別采集盛花期的雌花和雄花：雌花500—600朵；雄花800朵。

圖1　小果葉下珠Fig.1　P. microcarpus

1.2方法

1.2.1花氣味收集

(1)花氣味收集采用動態頂空吸附法進行花氣味收集[21]。主要工作流程：將采集好的花裝入無味透明的聚氟乙烯采集袋中(2 L，Teflon?FEP，大連德霖氣體包裝有限公司)，袋兩端分別留有進氣口和出氣口。首先，用空氣泵(FAY4002，成都氣海機電制造有限公司)將空氣通入活性碳管(外徑6 mm，長75 mm，Sigma-Aldrich公司，美國)內進行凈化，之后經由采集袋進氣口進入袋中，促使袋內花朵氣味揮發，最后用空氣泵將揮發的氣味經由采集袋出氣口抽出，導入Tenax TA(100 mg /50mg， 60/80目，Sigma-Aldrich公司，美國)吸附管(外徑6 mm，長75 mm)中進行吸附。通氣端和出氣端空氣流量分別用玻璃轉子流量器(LZB-4，天津流量儀表有限公司)控制，流速均為400 mL/min。連接裝置器件之間均用無味的特氟隆管(PTEE，VICI Jour公司，瑞士)連接。花氣味收集于18:30—23:30進行，持續5 h。在采樣過程中，用空氣作為對照，與花氣味收集同步進行。采集完畢后，用錫箔紙包裹吸附管并裝入密封袋內，置于超低溫冰盒帶回實驗室。

(2)花氣味洗脫及濃縮用正己烷(色譜純，Fisher公司，美國)反復洗脫吸附管3次，收集約0.5 mL洗脫液于2 mL棕色進樣瓶中。為進行樣品的定量分析，加入 500 ng正二十烷(色譜純，Sigma-Aldrich公司，美國)作為內標化合物，然后氮吹濃縮至100L，最后將樣品置于冰箱內(-18 ℃)保存，直至進行儀器分析時取出。

1.2.2花氣味化學分析

采用美國安捷倫科技公HP6890 (GC)-5973(MS)氣-質聯用儀進行氣味揮發物的化學分析。

(1)GC條件色譜柱為HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣量2 μL,采用分流模式，分流比4∶1；柱箱程序升溫40 ℃ 保持 5 min，然后以3 ℃/min升溫至 150 ℃，最后以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純He，流速1.0 mL/min。

(2)MS條件離子轟擊源設為掃描功能，掃描范圍35—500 amu，電離方式EI；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；離子源溫度 230 ℃；四級桿溫度150 ℃。

(3)揮發物的鑒定采用儀器自帶的標準譜庫(NIST 08)檢索定性確認揮發物的化學成分。運用峰面積歸一化法計算氣味各組分的相對百分含量。

1.3數據統計分析

所有數據均表示為平均值±標準差。采用Graphad Prism 5. 0軟件，對雌花和雄花氣味釋放量利用非配對樣本t檢驗比較兩者之間的差異性；采用SPSS17.0軟件，對小果葉下珠雌花和雄花氣味化學成分進行主成分分析，并利用非參數檢驗 Kruskal-Wallis test對兩者主成分進行差異顯著性檢驗。圖片均采用 Graphad Prism 5. 0軟件制作完成。

2　結果與分析

2.1花氣味化合物的組成

運用GC-MS對小果葉下珠花氣味成分進行化學分析，共鑒定出17種化合物(表1)，其中反-β-羅勒烯在雌花和雄花中含量均最高，分別揮發20.8 pg 和3.76 pg，各占相對百分含量的26.77%和17.97%，是花氣味的主要成分。此外，雌花氣味中還主要含有α-金合歡烯(16.61%)、順乙酸-3-己烯酯(15.97%)以及順-3-己烯-1-醇(10.92%)等物質；雄花氣味中還主要含有順乙酸-3-己烯酯(11.23%)、苯甲醚 (10.79%)以及β-欖香烯 (9.98%)等物質。

在檢測到的17中揮發物中，雌花和雄花各自所特有的揮發物僅3種，雌花：1-己醛、乙酸己酯和順-異戊酸-3-己烯酯；雄花：順-β-羅勒烯、β-欖香烯和香樹烯。兩者共同含有的多達12種。因此，雄花和雌花氣味化合物的組成模式基本相似。

表1　小果葉下珠花氣味揮發物的化學組成Table 1　The chemical composition of floral volatiles of both female and male flowers inP.microcarpus

2.2花氣味的化合物類別

小果葉下珠花氣味中共包含3種類型的化合物，包括脂肪酸衍生物、萜類(單萜類和倍半萜類)和芳香族化合物。從圖2可以看出：雌花和雄花中，均主要以萜類和脂肪族化合物為主；兩大類揮發物相對含量高達：87.81%和75.1%。此外，芳香族化合物在兩種花氣味中含量均最少。

2.3花氣味揮發物的釋放量

用內標法分別對小果葉下珠雌花和雄花氣味中各個組分進行定量，得到單位時間內單朵花揮發物的總揮發量，如圖3所示。雌花的揮發量高達(81.11±22.66)pg/h；而雄花僅為(20.68±3.10)pg/h，雌花的釋放量顯著高于雄花(t=5.21,P<0.005)。結果表明小果葉下珠雌花和雄花氣味存在明顯的量上的差異。

2.4雌花和雄花氣味差異性分析

對小果葉下珠花氣味頂空樣品(雄花4；雌花5)中17種化合物進行主成分分析，其結果如圖 4 所示。主成分1和2的累計方差累計貢獻率達到 64%，可認為這兩主成分包含了小果葉下珠花氣味中主要信息。小果葉下珠雄花和雌花氣味頂空樣品各自聚合在一起，兩者之間互相分離，沒有交叉或重疊。對兩個主成分進行非參數Krushal-Wallis 檢驗，結果顯示，用主成分1和2確實可以將雄花和雌花的氣味明顯區分開 (χ2=6，P=0.014)，以上結果說明小果葉下珠雄花和雌花的氣味化學成分存在明顯的差異，即具兩性異型性。

圖2　小果葉下珠雌花和雄花氣味不同類別化合物的相對含量Fig.2　Relative content of different chemical classes of the floral scents from female and male flowers in P. microcarpus

圖3　小果葉下珠雄花和雌花氣味揮發物總釋放量Fig.3　Total emission of scent compounds from male flower and female flower of P. microcarpus圖中不同小寫字母代表差異達到顯著水平，P<0.05

圖4　小果葉下珠雌花和雄花氣味化合物的主成分分析　Fig.4　Principal component analysis (PCA) of the scent compounds from the female and male flowers in P. microcarpus

3　討論

3.1小果葉下珠花氣味特異性信號及其組成特征

花氣味是由植物花瓣及腺體釋放的一類具有香氣的揮發性物質，作為一種古老媒介，在植物與昆蟲的相互關系中至關重要[22]。比如，傳粉昆蟲可通過識別植物氣味來尋找“特異”植株[23]。本研究從小果葉下珠花氣味中分離出17種揮發物。其中，順-β-羅勒烯在雌花和雄花中含量均最高，是主要成分(表1)。與頭細蛾傳粉相關的大戟科植物種類繁多[4,24]，但目前已鑒定出花氣味化學成分的僅2科6種植物[25-26]。已有研究顯示，小葉黑面神(Breyniavitis-idaea)花氣味主要物質是2-苯乙腈和2-苯乙醇；香港算盤子(Glochidion.zeylanicum)中主要含有反-β-羅勒烯，而披針葉算盤子(G.lanceolatum)中以芳樟醇為主，臺閩算盤子(G.rubrum)，倒卵葉算盤子(G.obovatum)以及里白算盤子(G.acuminatum)主要為順-β-羅勒烯和有芳樟醇[25-26]。除順-β-羅勒烯外，以上4種主要氣味物質均在小果葉下珠花中沒有檢測到。此外，在鑒定的17種化合物中，多達9種物質為小果下珠特有，在以上6種植物花中均無發現。因此，盡管到目前為止報道花氣味的植物數量有限，但通過以上對比發現，小果葉下珠花氣味與已報道的6種同科植物花氣味化學組成之間存在著一定的差異，具有種特異性。然而，還需進一步開展觸角電生理分析和昆蟲行為學實驗來鑒定特異性吸引小果葉下珠傳粉頭細蛾的活性物質。

Visser 提出，植物揮發物都通常以兩種方式實現其特異性：(1)依靠一些常見的化合物，通過不同種類，依照不同比例混合形成，即稱為“泛化”策略。(2)依賴一種或者某幾種稀有化合物實現特異性，即稱為“特化”策略[27]。Knudsen等歸納總結了利用頂空動態法收集的38目90科991物種，共發現1700 多種花香化合物[28]。Tomoko等研究表明，5種算盤子植物花氣味中42種化合物，高達30種存在其他開花植物中[25,28]。Svensson等研究顯示，吸引小葉黑面頭細蛾的主要物質2-苯乙醇和2-苯乙腈也分別廣泛存在于263種和68種植物中[26,28]。因此，已報道花氣味的與傳粉頭細蛾相關的大戟科植物均采取了“泛化”策略實現其氣味特異性，來吸引各自的傳粉者。然而，到目前為止，雞嗉子榕(Ficussemicorda)是植物與昆蟲專性傳粉互利共生體系中唯一種通過稀有化合物4-苯甲基醚，通過建立“私密通道”吸引其種特異性傳粉者Ceratosolengravelyi為其進行傳粉的植物[29]。在小果葉下珠花氣味中共分離出17中化合物(表1)，雌雄氣味花的主要物質順-β-羅勒烯不但存在于同科植物算盤子屬植物和黑面神中[26-27]，而且還廣泛存在于其他43科的植物花中[25]。另外，其它揮發物也存在于其他植物中[25]。因此，認為小果葉下珠花氣味主要是利用一些常見化合物，通過一定的比例混合形成其特異性“化學指紋圖譜”，來區別同科其他植物，介導傳粉頭細蛾找到宿主，這樣就維持了小果葉下珠和傳粉頭細蛾之間專性傳粉互利共生關系的高度種特異性。

3.2小果葉下珠花氣味兩性異型性

在一般的動物-植物(雌雄異花)傳粉系統中，植物雌花和雄花釋放的氣味通常相似，主要是由于它倆均吸引同一傳粉者。為確保傳粉者攜帶花粉在雌花和雄花之間的順利完成轉移，成功為植物授粉，植物會選擇進化出相似的雌花與雄花氣味信號[17-19]。此外，當植物花一方(通常為雄花)可為傳粉者提供報酬(取食花粉)或者繁殖場所，而另一方(通常為雌花)則不提供任何報酬。此時，無報酬方雌花通常會化學模擬釋放與雄花相似的氣味，來欺騙引誘傳粉者為其授粉[30]。兩性間氣味化學模擬現象在榕樹[19,28,31-32 ]和蘇鐵科植物[33-35]中普通存在。然而，本研究發現，小果葉下珠雌花與雄花間氣味存在著明顯差異，即花氣味具有兩性異型性(圖4)。同樣，由頭細蛾專性傳粉的小葉黑面神雌花與雄花之間氣味化學成分也存在分歧[27]。就雌雄異花的小果葉下珠而言，雌花和雄花在形態結構上存在明顯的差異(圖1)，兩性間花形態結構的這種差異可能會導致雌花與雄花產生的氣味不均一[29]。然而，Svensson等[27]提出一種適應性假設：傳粉頭細蛾在宿主小葉黑面神雌花和雄花上表現出明顯不同且高度程序化的傳粉行為：先在雄花采粉；然后為雌花傳粉并在其內產卵。推測宿主植物為了適應傳粉頭細蛾這種如此高度特異的傳粉行為，可能會選擇進化產生不同的花香，分別吸引頭細蛾完成極其不同的傳粉行為。頭細蛾在小果葉下珠和黑面神上的所表現出相似的傳粉行為[10-11]。因此，本文也支持以上適應性假設，認為小果葉下珠雌花和雄花氣味存在兩性異型性很可能是為適應頭細蛾這種高度特異的傳粉行為所致。然而，還需要進一步對非細蛾傳粉的大戟科植物花氣味兩異型性分析以及相關頭細蛾行為學等實驗對于此假設加以驗證。

此外，大多數昆蟲為植物傳粉同時，主要是為了從中尋求一定的報酬。植物雌花和雄花所提供的報酬不同可促使花信號兩性異型性的產生[20]。傳粉頭細蛾在小果葉下珠雄花上可以取食花粉作為食物報酬，然而，雌花可以為其提供產卵場所，可供其后代發育。因此，小果葉下珠雄花和雌花為頭細蛾提供的報酬不同，導致其花氣味產生兩性異型性。

3.3小果葉下珠花氣味釋放量的差異

本實驗結果顯示，單位時間內，小果葉下珠單朵雌花釋放量顯著高于雄花(圖3)。通過野外觀測，小果葉下珠雌花尺寸明顯大于雄花，推測雌雄間花朵尺寸大小的差異是可能導致小果葉下珠雌花氣味釋放量高于雄花的原因之一[30]。然而，Waelti等研究顯示，在白玉草(Silenelatifolia)-夜蛾(Hadenabicruris)育幼傳粉系統中，白玉草雄花雖小，但釋放的氣味明顯高于雌花，導致傳粉夜蛾更偏好選擇雄花，雄花可以吸引更多的傳粉者[36]。因此，還需要對小果葉下珠花氣味吸引傳粉頭細蛾生物學行為學實驗來進一步分析導致小果葉下珠花氣味釋放量的差異的原因。

4　結論

采用動態頂空吸附法收集小果葉下珠花氣味，運用GC-MS分析鑒定其化學成分，并利用主成分分析法比較雄花和雌花氣味之間的差異：

(1)小果葉下珠花氣味中共鑒定17種揮發物，以萜類和脂肪族物質為主，雌花與雄花主要成分均為順-β-羅勒烯，這些化合物形成吸引小果葉下珠頭細蛾特異性的化學信號，與已報道的6種頭細蛾相關植物的花氣味之間存在明顯的差異，這樣維持了小果葉下珠與頭細蛾專性傳粉互利共生關系的高度種特異性。

(2)小果葉下珠花氣味具有兩性異型性，雌花和雄花釋放不同的氣味，推測是為了適應頭細蛾在宿主上的高度特異的傳粉行為進化而產生，確保頭細蛾先在雄花上采粉，然后轉移至在雌花上傳粉并產卵，從而保證了兩者之間專性互利關系的穩定性。

研究表明：小果葉下珠花氣味及其兩性異型性對維持其與傳粉頭細蛾專性傳粉互利共生體系具有重要的化學生態學意義。

致謝：西南林業大學李宗波老師對實驗給予幫助,中國林業科學研究院熱帶林業研究中心梢平林場工作人員對野外采集工作提供支持，特此致謝。

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Analysis of the composition and sexual dimorphism of floral scent inPhyllanthusmicrocarpus

HUANG Daihong, CHEN Guoping, YANG Xiaofei, LI Houhun, SHI Fuchen*

CollegeofLifeScience,NankaiUniversity,Tianjin300071,China

Obligate pollination mutualisms between plants and their seed-parasitic pollinators are known to be one of the most specialized plant-insect interactions. The obligate pollination mutualism betweenEpicephalamoths (Gracillariidae) andPhyllanthusmicrocarpusplants (Phyllanthaceae) has been documented.P.microcarpusspecies need to rely on species-specificEpicephalafemale moths for obligate pollination. At night, a female moth actively collects pollen grains from the host male flower by using unique proboscises equipped with numerous hair, and then deposits them on the female flower; subsequently, the female moth lays an egg by using the specialized acicular ovipositor. The hatched larva consumes only a subset of the maturing seeds within a single fruit to complete its development and drills out of the fruit. The rest of the seeds ensure the reproduction of the host′s offspring. The floral scent has been considered to be the key signal guiding obligate pollinators to locate host plants in nursery pollination mutualisms; however, studies on floral volatiles ofP.microcarpusare lacking. In this study, the chemical composition of floral volatiles of both female and male flowers fromP.rmicrocarpuswas analyzed using the dynamic headspace technique and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Whether there are qualitative differences in floral scent between the sexes ofP.microcarpuswas determined by conducting principal component analysis (PCA). The results showed that (1) a total of 17 compounds were detected and identified from the floral scent ofP.microcarpus, which were dominantly terpenoid and aliphatic compounds. (E)-β-Ocimene was found in the highest amounts in both female (26.77%) and male flowers (17.97%) and was thus considered as the major scent component ofP.microcarpus. Of the 17 identified volatiles, 12 occurred in both female and male flowers, indicating similar chemical composition patterns of floral scent between both the sexes ofP.microcarpusis obviously different from other Phyllanthaceae plants whose floral scent has been identified in the chemical composition of floral scent. (3) Female flowers emitted significantly more amounts of odor than male flowers. (4) The PCA revealed thatP.microcarpusspecies showed qualitative differences in chemical composition of floral scent between male and female flowers, indicating sexual dimorphism in floral scent. These results indicated that the species-specific floral scent ofP.microcarpusmight mediate the obligate pollinatorEpicephalamoth to find the host in order to maintain in the high species specificity ofP.microcarpus-Epicephalamutualism. The sexual dimorphism in floral scent ofP.microcarpusmight be an important reason for the host to adapt to the highly specializedEpicephalapollination.

obligate pollination; mutualism;Phyllanthusmicrocarpus;Epicephala; floral scent; sexual dimorphism

10.5846/stxb201411212307

國家自然科學基金重點資助項目(30930014)

2014-11-21; 網絡出版日期:2015-10-29

Corresponding author.E-mail:fcshi@nankai.edu.cn

黃代紅，陳國平，楊曉飛，李后魂，石福臣.小果葉下珠花氣味組成及其兩性異型性.生態學報,2016,36(13):4013-4020.

Huang D H, Chen G P, Yang X F, Li H H, Shi F C.Analysis of the composition and sexual dimorphism of floral scent inPhyllanthusmicrocarpus.Acta Ecologica Sinica,2016,36(13):4013-4020.