吉林省天然黃檗種群遺傳多樣性ISSR分析

李紹臣, 李鳳明, 張立民, 任　軍, 林玉梅

吉林省林業科學研究院, 長春　130033

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吉林省天然黃檗種群遺傳多樣性ISSR分析

李紹臣, 李鳳明*, 張立民, 任軍, 林玉梅

吉林省林業科學研究院, 長春130033

黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)是吉林省長白山林區珍貴用材樹種和主要建群樹種，由于過度采伐和利用，其資源數量和質量明顯下降。依據其資源自然分布現狀，選擇了10個具有代表性的天然黃檗分布種群，應用ISSR標記技術對其進行了遺傳多樣性的分析，以期為黃檗種群資源的收集、保存和保護提供依據和支持。研究結果表明：從60條ISSR引物中篩選出擴增99條帶，多態性條帶數為54條，多態性比率為54.5%。10個種群的多態位點比率分布在18.52%—37.96%范圍內，其中琿春種群的多態位點比率最高，為37.96%,吉林省露水河種群的多態位點比率最低為18.52%，種群的平均多態位點百分比為26.02%。利用Shannon指數與Nei指數可較好的估算黃檗種群間的遺傳變異，Shannon指數的變化范圍在0.1103—0.1949之間，Shannon指數總體平均值為0.1522。 Nei指數的變化范圍在0.0759—0.1327之間, 平均為0.1043。根據Nei法計算黃檗10個種群遺傳多樣性是Dst=0.1586，分化指數Gst=0.6183，基因流系數Nm為0.3086，總的遺傳變異中有61.83%的變異存在于群體間，群體內的變異只占38.17%，種群間存在明顯分化。黃檗的10個種群可分為兩個大群，即：①松江河、露水河、灣溝、集安、輝南②白石山、汪清、安圖、延吉、琿春。根據黃檗的遺傳結構提出了保護措施:適度引導營造藥用或用材林；開展本地黃檗資源的本底調查并進行資源匯總(包括林班、小班，每株的樹齡、樹高、胸徑、枝下高和冠幅等數據)，篩選本地的優勢群體進行原地保存；遷地保護策略中要增加樣本的數量，白山地區遷地保護的種源應選擇松江河、露水河種源，通化地區遷地保護的種源應選擇集安種源，而延邊地區應選擇白石山和汪清種源；人工促進黃檗的天然林更新改造，逐步恢復黃檗種群規模，并且進行人工更新的資源登記。

黃檗；遺傳多樣性；ISSR

黃檗(黃柏，黃菠蘿PhellodendronamurenseRupr.)，屬蕓香科黃檗屬落葉闊葉喬木，是東北地區地帶性植被頂級群落——闊葉紅松林的主要伴生樹種、主要的用材樹種和藥用植物[1]。由于過度的利用，目前已成為國家級重點保護植物。黃檗在吉林省主要分布在東部山區，包括延邊、白山、通化、吉林等，目前對黃檗的研究多集中于育種造林[2-4]、植物化學[5-6]等方面, 有關遺傳多樣性方面的工作較少[7-8]，閆志峰僅對吉林省的3個種群進行了AFLP分析。迄今對其遺傳多樣性和遺傳結構知之甚少, 以至于無法提出有針對性的保護策略。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)技術[9-10]是由Zietkiewicz等于1994年創建的一種簡單序列重復區間擴增多態性分子標記，近年來，已被廣泛應用于遺傳多樣性和群體遺傳結構的研究[11-14]。本研究采用先進的ISSR技術，運用群體遺傳學原理，從DNA水平對黃檗天然種群的遺傳多樣性進行研究，揭示不同地區黃檗天然種群的遺傳關系，探討黃檗天然種群的遺傳分化機制，為黃檗遺傳資源的有效保護和合理利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

黃檗在吉林省主要分布在東部山區，根據地理位置和吉林省森林資源調查文獻以及種群分布的具體情況確定了10個有代表性的天然種群，采樣時間是2013年3月在各采樣點進行采樣，每個地點采25個樣本。為了使樣本具有代表性，各個樣本間相互距離要在100m以上，林分選擇要求立地較好的近熟林分，采無病蟲害的枝條拿回實驗室水培，待葉子長出后采摘葉片提取DNA。10個天然種群的基本情況見表1。

1.2總DNA的提取

利用Universal genomic DNA extraction kit(Ver.3.0,TaKaRa, 大連)提取黃檗葉片總DNA。

1.3ISSR引物篩選

根據University of British Columbia(UBC)提供的ISSR引物序列，在上海生工公司合成60個2核苷酸重復的引物。每個種群隨機選擇1個DNA模板進行擴增篩選，從60個ISSR引物中篩選出10個能產生多態、清晰且可重復條帶的引物，用于全部10個種群樣本分析。各引物序號及序列見表2。

表1　10個種群黃檗的地理氣候因子Table 1　Factors of geographical and climatic of 10 Provenance of P. amurense Rupr.

表2　ISSR引物序號與序列Table 2　Primer sequence number and sequence

1.4ISSR-PCR擴增及擴增產物的電泳檢測

用篩選出的10個引物，對10個種群的250個DNA樣本進行ISSR-PCR擴增，擴增產物用1×TAE電泳緩沖液(pH 8.0)在1.0%的瓊脂糖凝膠中(含EB0.5μg/ml)電泳2h，電壓為5V/cm，以分離擴增產物。DL2000(寶生物公司生產)作為分子量標準，電泳結果用Gene Genius公司的Bio Imaging System凝膠成像系統照相，記錄結果。

1.5ISSR數據的統計分析

ISSR-PCR產物經電泳分離后，對擴增結果進行記錄。具體的譜帶記錄方法目前無明確的標準，本研究參考鄒喻平等的方法[15]，以Marker產生帶亮度為標準，亮的記為1，弱的、無帶的記為0；建立0/1數據矩陣。為盡量減少誤差，譜帶結果的記錄始終由試驗者一人進行。得到的ISSR數據矩陣用于以下分析：1)將ISSR標記視為表征性狀， 應用POPGENE軟件(Version 1．3．1)計算多態位點百分率(PPL)和Shannon信息多樣性指數(I)；2)將ISSR標記視作同一基因座位上的2個等位基因，基于Hardy．Weinberg平衡，刪除基因頻率小于3/N(N為樣本數，N=192)的條帶后[16]，分別計算Nei′s基因多樣度指數(HE)、種群總基因多樣度(H′)、種群內基因多樣度(Hs)、基因分化系數(Gst)和Nei′s遺傳距離(D)；3)基于POPGENE軟件對種群間Nei′s(1978)無偏遺傳距離(unbiased genetic distance)的估算，用Mega2(molecular evolutionary genetics analysis)軟件中的UPGMA聚類法以遺傳距離對種群進行聚類分析。4)用AMOVA．PREP軟件計算個體間歐氏距離所得的輸出文件(距離文件、組文件、群體文件)作為輸入文件，用WINAMOVA軟件進行分子方差分析，并以種群為單位，采用Mantel檢驗分析10個種群間遺傳距離和地理距離的相關性。

2　結果與分析

2.1黃檗地理種群的遺傳多樣性

2.1.1黃檗擴增產物的多態性

從60條ISSR引物中篩選出擴增條帶清晰、重復性高的引物10條(表2)。ISSR擴增的條帶在500bp—2500bp之間，圖1為813擴增結果。10條引物共擴增出99條帶，多態性條帶數為54條，多態性比率為54.5%。

圖1　引物813對部分材料進行擴增Fig.1　813 primers for amplification part materialM為標準分子量DL2000M is a standard molecular weight DL2000；1—20為部分個體1—20 for part of the individual

由表3可以看出，10個種群的多態位點比率分布在18.52%—37.96%范圍內，其中琿春種群的多態位點比率最高，為34.26%，吉林省露水河種群的多態位點比率最低為18.52%，種群的平均多態位點百分比為26.02%。可見，種群間的多態位點百分比差距較大，琿春種群的多態位點百分比是露水河種群的2倍左右，說明琿春種群遺傳基礎較寬，具有較好的適應性。

表3　黃檗10個種群的多態性及遺傳差異統計Table 3　The polymorphic loci and genetic diversity in 10 provenance of P. amurense Rupr.

2.1.2黃檗種群的Shannon信息指數分析和Nei遺傳多樣性指數分析

利用PopGen 1.32軟件對黃檗種群進行遺傳多樣性分析，獲得了黃檗總體的Shannon信息指數以及每個種群的Shannon信息指數。

由表3看出，黃檗總體的Shannon指數為0.1949，各個種群的Shannon多態性信息指數中，琿春種群最大，達到0.1949，露水河種群最小，為0.1103。Shannon指數總體平均值為0.1522。

所研究的黃檗每個種群的Nei指數分布在0.1327—0.0759范圍內，平均為0.1043。所有種群根據Nei指數排列的順序與根據Shannon指數排列的順序基本一致。與按多態位點百分比排列的順序有些差距，這主要是由于多態位點百分比居中的幾個種群間百分比差距不大的原因。

2.1.3黃檗各種群間的遺傳分化分析

根據總的遺傳多樣性(Ht)和群體內遺傳多樣性(Hs)計算不同群體間的遺傳多樣性(Dst，Dst=Ht-Hs)和遺傳分化水平(Gst，Gst=Dst/Ht)。10個黃檗種群間的遺傳多樣性是Dst=0.1586，分化指數Gst=0.6183，基因流系數Nm為0.3086(表4)。

表4　不同種群間的遺傳分化分析Table 4　Analysis of genetic differentiation among provenances

由結果可見，總的遺傳變異中有61.83%的變異存在于群體間，群體內的變異只占38.17%，種群間的遺傳變異占相當大的比重；基因流系數也遠小于1，說明種群間存在明顯的分化，因此黃檗種群的利用潛力很大。

2.2黃檗種群的聚類分析

為了進一步分析群體之間的遺傳分化程度，計算了Nei′s的遺傳距離(D)。遺傳距離常用來衡量群體間的親緣關系，遺傳距離越大，說明群體間的親緣關系越遠；反之，遺傳距離越小，群體間的親緣關系越近。

圖2　黃檗種群間遺傳關系UPGMA聚類圖　Fig.2　The genetic relationship between Huang Bo provenance UPGMA clustering figure

根據Nei′s遺傳距離利用MEGA軟件構建的群體遺傳關系UPGMA聚類圖見圖2。聚類圖中將黃檗的10個種群分為兩個大群，即：①松江河、露水河、灣溝、集安、輝南②白石山、汪清、安圖、延吉、琿春。其中，在群①中，又可分為2個小群，其中松江河、露水河和集安種群間的遺傳距離較小，較早的聚為一支，灣溝和輝南種群間的遺傳距離較小，較早的聚為一支；在群②中，又可分為2個小群，其中延吉、安圖和琿春種群間的遺傳距離較小，較早的聚為一支，白石山和汪清種群間的遺傳距離較小，較早的聚為一支。

3　討論

3.1黃檗遺傳多樣性的ISSR分析

遺傳多樣性是指存在于生物個體內、單個物種內以及物種之間的基因多樣性。一個物種的遺傳多樣性說明了該物種在特定的環境因子作用下，其基因的豐富程度，而這是物種適應和進化的遺傳基礎。本文所檢測到的108條多態位點的平均有效等位基因數目為1.1864，Shannon指數為0.1522，Nei指數為0.1043，低于閆志峰的1.2487,0.1524,0.2374[7]。遺傳參數略低的原因是本文所用的種群都是來源于吉林省境內。單就這3個指標來說，黃檗的遺傳多樣度是中等的。但從多態位點百分率來看， 10個種群的多態位點比率分布在18.52%—37.96%范圍內，其中琿春種群的多態位點比率最高，為34.26%，吉林省露水河種群的多態位點比率最低為18.52%，種群的平均多態位點百分比為26.90%。可見，種群內的多態位點比率相對總的多態位點比率小很多，但種群間的多態位點百分比差距較大，琿春種群的多態位點百分比是露水河種群的2倍左右，可以據此選擇環境適應性強的種群。遺傳變異在物種或是群體的分布形式及其時間上是以非隨機方式變化的。遺傳變異受突變、基因流、選擇和遺傳漂變的共同作用，同時還和物種的進化史和生物學特性有關[17-18]。本試驗利用多態性位點分析來度量遺傳變異水平的高低，而用Nei 法求出基因多樣性，反映種群的多態性；利用Nei指數來估測實驗獲得的shomnon指數的變化范圍來估測黃檗種群間及種群內的遺傳分化。Nei指數(H*)和Shannon指數(I*)估算所得的10個黃檗種群的遺傳變異結果基本是一致的，數據都表明在這10個種群中，遺傳變異最高的是琿春種群，其次是灣溝種群，遺傳變異最低的是露水河種群。遺傳變異最高和最低的種群地理距離很遠，遺傳距離也較遠。Nei基因分化系數為61.83%，Nei種群間基因多樣性為15.86%，說明黃檗種群遺傳差異較大，具有豐富的遺傳基礎。在本文中，應用ISSR分子標記技術，通過研究黃檗種群之間的遺傳距離和聚類樹形圖，根據Nei′s遺傳距離利用MEGA軟件構建的群體遺傳關系UPGMA聚類圖。在0.20的遺傳距離上將黃檗的10個種群分為兩個大群，地理種群近的都很 好的聚在了一起，種群間遺傳距離越小，說明這幾個種群在遺傳組成上越相似，親緣較近。

3.2黃檗種群的保護策略

黃檗為名貴中藥材和優質木材,其應用范圍較廣。黃檗的優勢群體主要分布在河谷兩側的含腐殖質豐富的中性或微酸性沖積土，因此，其分布區較為狹窄，加之長期的認為干擾,造成生境的間隔化和種群數量變小,相互隔離的小種群使黃檗的遺傳基礎越來越窄, 而且本研究也證實了不同種群間的親緣關系較近。根據黃檗的生存現狀及遺傳結構特點,提出保護策略：(1)結合禁止采伐的同時，應加強宣傳教育力度, 嚴禁盜伐黃檗林木的行為，此外，可以適度引導營造藥用或用材林，滿足其供應和需求。(2)開展本地黃檗資源的本底調查并進行資源匯總(包括林班、小班號，每株的樹高、胸徑、枝下高和冠幅等數據)，篩選本地的優勢群體進行原地保存，既重視保護黃檗的高水平遺傳多樣性種群, 又兼顧低水平地區稀有基因的存在，保護黃檗種群的完整性。 (3)加強遷地保護，在遷地收集時應結合自然林和人工林的特殊群落特征，既保護其資源，又能豐富其遺傳多樣性，同時建立種質資源收集圃, 根據遺傳結構進行合理取樣,豐富現有種質資源。在遷地保護策略中要增加樣本的數量，而且吉林省白山和通化地區遷地保護的種源應選擇松江河、露水河和集安種源，而延邊地區應選擇白石山和汪清種源。(4)為防止該物種的遺傳退化, 應積極創造適宜條件促進黃檗種子的原地萌發, 人工促進天然更新，逐步恢復黃檗種群規模，并且進行人工更新的資源登記。

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Analysis of genetic diversity in wild populations ofPhellodendronamurenseRupr. in Jilin Province using inter-simple sequence repeat

LI Shaochen, LI Fengming*, ZHANG Limin, REN Jun, LIN Yumei

JilinAcademyofForestryScience,Changchun130033,China

PhellodendronamurenseRupr. is a valuable timber species and a key species in the plant communities of Changbai Mountain in Jilin province; however, due to over-harvesting and utilization, its quantity and quality have clearly declined.. Therefore, based on its distribution on Changbai Mountain in Jilin province, 10 representative populations ofP.amurensewere selected, and their genetic diversity was investigated using the Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) technique. Using the ISSR data, the Nei and Shannon indices were determined to estimate the genetic variation of the 10 populations. This study aims to provide foundational data for preservation and protection ofP.amurense. Using 60 ISSR primers to screen the 10 representative populations ofP.amurense, 99 bands were amplified; 54 bands were polymorphic (54.5%). The polymorphism of the 10 populations ranged from 18.52% to 37.96%; the Hunchun population showed the greatest polymorphism, at 37.96%, the Lushuihe population showed the least, at 18.52%, and the average was 26.02%. The Shannon index ranged from 0.1103 to 0.1949, with an average of 0.1522. The Nei index ranged from 0.0759 to 0.1327, with an average of 0.1043. According to Nei′s method calculation of Phellodendron amurense 10 population genetic diversity is the DST = 0.1586, the differentiation index (GST = 0.6183, gene flow coefficient nm is 0.3086... The total genetic variation of 61.83% of the variation existed among populations, and the variation within population was only 38.17%..A cluster map of the unweighted pair-group method with arithmetic means(UPGMA) relationships, using the ISSRs as molecular markers, was constructed. The 10 populations could be divided into two groups: 1) Songjianghe, Lushuihe, Wangou, Ji-an, and Huinan provinces, and 2) Baishi Shan, Wangqing, Antu, Yanji, and Hunchun provinces. Based on the genetic structure ofP.amurense, protection measures were put forward, including guidance to create a medicinal or timber forestry. The local plant resources background investigation and summary of resources (including compartments, sub-compartments, each plant′s age, height, diameter, height under crown and crown). To select the local dominant groups to carry on in situ conservation. Ex situ conservation strategies should be used to increase the number of individuals; in the Baishan area, the Songjianghe, Lushuihe provinces should be selected, in the Tonghua Area,the Ji-an provinces should be selected,in the Yanbian area, the Wangqing and Baishi Shan provinces should be selected. Artificial propagation ofP.amurenseshould be used to promote the gradual recovery of populations, and resource manual registration should be established.

P.amurense; genetic diversity; ISSRs (Inter-Simple Sequence Repeats)

10.5846/stxb201411142255

國家“十二五”科技支撐計劃項目資助(2012BAD22B04)

2014-11-14; 網絡出版日期:2015-10-30

Corresponding author.E-mail: lkylfm@126.com

李紹臣, 李鳳明, 張立民, 任軍, 林玉梅.吉林省天然黃檗種群遺傳多樣性ISSR分析.生態學報,2016,36(13):4006-4012.

Li S C, Li F M, Zhang L M, Ren J, Lin Y M.Analysis of genetic diversity in wild populations ofPhellodendronamurenseRupr. in Jilin Province using inter-simple sequence repeat.Acta Ecologica Sinica,2016,36(13):4006-4012.