羊草基因型數目與氮添加對土壤微生物群落的交互影響

辛曉靜, 劉　磊, 申俊芳, 趙念席，高玉葆

南開大學生命科學學院， 天津　300071

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羊草基因型數目與氮添加對土壤微生物群落的交互影響

辛曉靜, 劉磊, 申俊芳, 趙念席*，高玉葆

南開大學生命科學學院， 天津300071

物種多樣性(或同一物種遺傳多樣性)減少和氮富集都是影響陸地生態系統進程的主要因素，它們之間的交互作用是否對土壤微生物群落產生顯著影響已成為研究者關心的主要科學問題。研究羊草基因型數目(1、2、4三種基因型數目組合)和氮添加(無氮添加、低氮添加和高氮添加3種水平)對土壤微生物群落的總磷脂脂肪酸(PLFA，Phospholipid Fatty Acid)含量、細菌PLFA生物標記含量、真菌PLFA生物標記含量、真菌/細菌比、以及基于每個PLFA生物標記相對含量百分比所得微生物群落的Shannon-Wiener多樣性指數和Simpson優勢度指數的影響。結果表明：氮添加對細菌PLFA生物標記含量，以及土壤微生物PLFA生物標記的Shannon-Wiener多樣性指數和Simpson優勢度指數具有顯著影響(P<0.05)；基因型數目對所測變量無顯著影響(P> 0.05)，但基因型數目和氮添加的交互作用對細菌PLFA生物標記含量和真菌/細菌比具有顯著影響(P<0.05)。研究結果為全球變化背景下氮沉降及重要物種種群數量減少對土壤微生物群落的影響提供了科學數據，為合理解釋群落動態變化提供了數據支持。

基因型數目；氮添加；微生物群落；羊草

化石燃料燃燒(導致大氣氮沉降)、施肥措施(氮添加)等人類活動的加劇，導致全球氮富集逐漸增加[1]，已經對陸地生態系統產生了非常顯著的影響[2]，這些影響既包括對地上部植物多樣性(物種多樣性和同一物種遺傳多樣性)變化的影響，也包括對地下微生物群落組成和結構的影響，使氮富集成為引起群落退化的主要因素之一。如Zavaleta等在加里福尼亞草原生物保護區進行了為期3a的模擬氮沉降實驗，結果發現氮沉降使實驗區的植物種類減少5%[3]；Schmidt等對一苔原群落模擬氮添加的實驗發現，氮添加引起土壤微生物的含量降低且結構和功能發生變化[4]。

隨著群落植物多樣性的改變，土壤微生物多樣性及其功能也會相應地發生變化[5]。一方面是由于不同植物個體(種類)輸入土壤的有機質類型、復雜性及總量不同而直接影響地下微生物群落[6]；另一方面，植物性狀如地上生物量、根系深度和密度以及根冠比的種間(種內)差異可特異性地影響土壤環境，如濕度、溫度、pH等，從而間接影響土壤微生物群落[7-8]。近年來，在物種較少、相對脆弱的生態系統中，重要物種基因型多樣性表現出與群落內物種多樣性相似的生態功能被廣泛證實，如與較少基因型個體組成的種群相比，多基因型個體組成的種群能提高地上部初級生產力、增加地上部節肢動物的多樣性、加速凋落物分解等[9-11]，但基因型數目是否對土壤微生物群落產生影響的研究則剛剛起步[12-13]，Schweitzer等研究發現，隨楊樹(Populus)基因多樣性增加，土壤微生物群落組成呈單峰變化，這可能與基因多樣性能改變土壤營養物質的可利用性有關[13]。

植物多樣性(種間和種內水平)減少和氮富集對陸地生態系統的影響很早就受到了生態學家的廣泛關注[14-15]，已有相關研究分別探討了植物多樣性減少或氮添加單一因素對生態系統功能的影響[2,5]，而關于這兩個因子的交互作用是否影響生態系統功能的相關研究卻很少[16-18]，關注它們是否交互影響土壤微生物群落的研究則更少[17-18]。受全球變化(氮沉降、干旱、過度放牧等因素)的影響，中國北方典型草原退化嚴重，已有研究證實氮添加導致群落建群種羊草(Leymuschinensis)和大針茅(Stipagrandis)等多年生禾草數量降低[19]，但建群種種群數量減少是否會與氮添加交互影響生態系統功能(如土壤微生物群落的結構與功能)的相關研究還未展開。

羊草作為內蒙古草原的建群種之一，具有生態幅廣、適應性強等特點。另外，羊草作為根莖型禾草，通過克隆繁殖，某個特定的基因型在群落中也能起到很重要的作用。最近有研究發現，不同基因型羊草數量性狀間存在分化(包括與生長相關的比葉面積、與防御相關的葉片總酚濃度等等)，且這種分化具有遺傳基礎[20]；多基因型組合羊草種群在提高種群生產力以及抗干擾方面存在正效應，對正效應起主要貢獻的是類似于物種之間的生態位互補效應[21]。因此，本研究以該區域重要建群種羊草為研究對象，構建不同基因型組合的羊草種群，通過氮添加模擬氮沉降，在人工控制條件下研究羊草基因型數目、氮添加以及它們的交互作用對羊草地下部微生物群落組成和結構的影響。以期在大氣氮沉降逐漸增加的背景下，探討羊草(Leymuschinensis)種群基因型多樣性在保持內蒙古溫帶典型草原土壤微生物多樣性方面的作用。重點關注以下問題：(1)羊草基因型數目對土壤微生物群落的組成及結構是否影響顯著；(2)氮添加如何影響土壤微生物群落的含量及多樣性；(3)羊草基因型數目和氮添加的交互作用是否影響土壤微生物群落的組成及結構。

1　材料和方法

1.1實驗材料

本實驗所用羊草為2010年于內蒙古錫林浩特市阿巴嘎典型草原西界采集的羊草基株，利用ISSR分子標記(AG)7T和(CA)6A確定不同基因型基株[22]，并編號。在相同條件下培養，除去母體效應，通過根莖無性繁殖得到同一基因型的大量分蘗。2014年6月19日，利用這些羊草分蘗進行實驗。

1.2實驗方法

本實驗采用兩因素三水平隨機實驗設計，因素一為氮添加，包括無氮添加(N0)、低氮添加(NL)及高氮添加(NH)3個水平，因素二為羊草基因型數目，包括單基因型(G1)、兩基因型(G2)及四基因型(G4)3種基因型數目組合，共構建9種處理的實驗種群。在直徑19cm的塑料盆中，放入2.5kg的砂土和50g內蒙古典型草原區羊草草原原生生境地表新鮮土壤，每盆中分別移栽4株羊草單株分蘗。本實驗共使用9種羊草基因型，每種氮添加處理下，移栽單基因型(G1)9盆，兩基因型組合(G2)5盆，四基因型組合(G4)3盆，共17盆；3種氮添加處理總共51盆，基因型組合方式見表1。移栽時，將羊草基株的分蘗統一去除根莖并以基因型編號進行標記，修剪使得地上部高度為15cm，地下根系長度為10cm，地上部葉片數為4片。對移栽1周內死去的分蘗重新種植。

表1　本研究所用基因型組合方式Table 1　Genotype combinations in the present study

經過一段時間恢復生長，2014年8月13日，對實驗種群進行氮添加處理，無氮添加(N0)、低氮添加(NL)和高氮添加(NH)為每周每盆分別施加0、10、30 mL的0.0125 mol/L NH4NO3溶液，按全年52周計算，對應的施氮量分別為0、6.42、19.24 g N/m2/a，施氮標準參照齊玉春等[23]、張菊等[24]略作改動；本實驗共施氮16次。實驗期間，土壤濕度控制在(10 ± 2)% 左右，除定期施加NH4NO3溶液外，無其他營養添加，定期除去雜草，無高溫和遮陽等脅迫；所有盆隨機放置，每周更換位置以避免位置效應。2014年11月28日，收集每盆中間位置的土壤作為根系土，立即過直徑1 mm篩，除去植物殘余根系后于-80℃冰凍保存，用于土壤微生物磷脂脂肪酸(PLFA, Phospholipid Fatty Acid)生物標記分析。

本研究采用磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid, PLFA)溫和甲酯化法[25]進行土壤微生物PLFA生物標記提取，利用氣質聯用色譜分析儀(Agilent 7890GC 5975MSD)進行PLFA生物標記分離及鑒定[26]。對C14—C20之間成功分離的PLFA生物標記進行含量計算及表征分類[27]。其中，表征細菌的為i14:0、i15:0、16:1ω7c、a16:0、i16:0、cy17:0、i17:0、17:0、18:1ω7c；表征真菌的為18:2ω6，9c、18:1ω9c[27-28]。

1.3數據分析

PLFA生物標記含量計算公式為：

PLFA(nmol/g干重)=(PPLFA×S×V)÷(POSTD×D×R×W×M)

式中，PPLFA和POSTD分別是樣品和標準物質的峰值面積，S為內標標準物質的濃度(ng/μL)，D為稀釋倍數，R為分取倍數，V為樣品的測定體積(μL)，W為土壤干重(g干重)，M為相應的PLFA的相對分子質量。

PLFA生物標記生態學參數：

Shannon-Wiener多樣性指數(Shannon-Wiener diversity index)[29]：

H=-∑pilgpi

Simpson優勢度(Simpson dominance index)[30]：

式中，pi為第i種PLFA生物標記在樣品中的相對含量百分比。

將樣品中是否檢測到某一特定PLFA標記為1或0構建0、1矩陣，基于矩陣計算樣品間的Jaccard′s相似性系數，并基于相似性系數構建UPGMA聚類圖；統計每個樣品中檢測到的PLFA生物標記總數及表征細菌、真菌和未分類的PLFA生物標記種類數。

由于本研究中各處理間重復不等，因此采用混合線性模型(Mixed model)雙因素分析來檢驗羊草基因型數目、氮添加以及它們的交互作用對土壤微生物群落組成和結構(PLFA總量，Shannon-Wiener多樣性指數、Simpson優勢度，細菌PLFA生物標記含量，真菌PLFA生物標記含量，真菌/細菌比)以及檢測得到的生物標記種類數的影響，羊草基因型數目和氮添加設為固定因子。對于雙因素分析中被檢測的受交互作用顯著影響的變量，進一步進行簡單效應分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)Duncan檢驗來檢測相同的氮添加(基因型數目)條件下，基因型數目(氮添加)是否對該變量平均值影響顯著；而對僅受單一因素顯著影響的變量，進一步利用單因素方差分析(one-way ANOVA)多重比較Duncan檢驗來檢測不同處理是否對該變量的平均值影響顯著。以上數據分析利用SPSS 21.0完成，在進行統計檢驗之前對數據進行轉換以滿足正態分布和方差齊性。

2　結果與分析

2.1不同處理下土壤微生物PLFA生物標記種類

對C14—C20PLFA生物標記進行統計，共得到41種生物標記，每個樣品中得到的5 —15種PLFA生物標記，其中低氮添加四基因型組合(NLG4)處理組的一份樣品中檢測到的PLFA生物標記最少，而無氮添加兩基因型組合(N0G2)處理組的一份樣品中檢測到的PLFA生物標記最多。沒有任何PLFA生物標記出現在所有樣品中。只有兩種PLFA生物標記，16:0和18:0，在大于45份樣品中被檢測到。其中，16:0在無氮添加單基因型(N0G1)、低氮添加單基因型(NLG1)和無氮添加兩基因型組合(N0G2)的一些樣品中未被檢測到，而18:0在低氮添加多基因型組合(NLG2和NLG4)各一個樣品中未檢測到。有8種PLFA生物標記僅在一個樣品中被檢測到(表2)。

對不同處理得到的PLFA生物標記的種類數進行分析，發現總PLFA生物標記和未分類PLFA生物標記在處理間無顯著差異，而細菌PLFA生物標記和真菌PLFA生物標記在處理間差異顯著(P< 0.05)。細菌PLFA生物標記種類數最高的出現在無氮添加四基因型組合(N0G4)處理組，顯著高于高氮添加單基因型(NHG1)和低氮添加多基因型組合(NLG2和NLG4)處理組；而真菌PLFA生物標記在3個高氮處理組較高，顯著高于其他處理組(無氮添加單基因型N0G1除外)(表3)。

表2　51份土壤樣品中檢測得到的PLFA生物標記種類及歸類情況Table 2　The type and classification of PLFA biomarkers detected in 51 soil samples

表3　不同處理對土壤微生物PLFA生物標記的種類數的影響Table 3　The effects of different treatments on the amount of microbial PLFA biomarkers(mean ± SE)

2.2不同處理對土壤微生物群落組成及結構的影響

雙因素分析結果顯示，羊草基因型數目、氮添加以及它們的交互作用對總PLFA生物標記和真菌PLFA生物標記含量均無顯著影響，而氮添加對細菌PLFA生物標記含量、群落Shannon-Wiener指數、Simpson優勢度指數具有顯著影響，即氮添加主效應顯著；氮添加和基因型數目交互作用對細菌PLFA生物標記含量、真菌/細菌比具有顯著影響(表4)。對受交互作用顯著影響的兩個變量(細菌PLFA生物標記含量和真菌/細菌比)，進一步進行簡單效應分析，結果顯示：在基因型數目為2(G2)的條件下，低氮添加顯著降低了細菌PLFA生物標記含量，其他條件下未檢測到對細菌PLFA生物標記含量的顯著影響；而氮添加對單基因型和四基因型組合真菌/細菌比均具有顯著影響，但無規律可循(圖1)。無氮添加(N0)條件下，基因型數目的增加顯著影響了真菌/細菌比，單基因型(G1)條件下真菌/細菌比顯著高于多基因型條件下的真菌/細菌比(圖1)。對僅受氮添加影響的兩個變量進行多重比較分析，結果顯示：Shannon-Wiener多樣性指數和Simpson優勢度表現出相同的趨勢，均為無氮添加(N0)處理顯著高于低氮添加(NL)處理組，且這種差異主要體現在無氮添加單基因型(N0G1)組顯著高于低氮添加四基因型組合(NLG4)組(表4，圖2)。

表4　羊草基因型數目、氮添加及其交互作用對根際土壤微生物群落的影響Table 4　The effects of genotype number, nitrogen addition and their interactions on the responses of microbial community

e圖1　不同處理條件下細菌PLFA生物標記含量及真菌/細菌比Fig.1　The biomass of bacterial PLFA biomarkers and fungal to bacterial ratio under different treatmentsN0、NL和NH分別表示無氮添加、低氮添加和高氮添加，G4、G2和G1分別表示四基因型組合、兩基因型組合和單基因型;相同字母表示處理間差異不顯著(P > 0.05)，其中，英文字母表示相同基因型數目，氮添加處理的影響；而希臘字母表示相同氮添加條件下，基因型數目的影響

圖2　不同處理條件下土壤微生物群落Shannon-Wiener多樣性指數和Simpson優勢度指數Fig.2　Shannon-Weiner diversity index and Simpson dominance index of microbial community under different treatments相同字母表示處理間差異不顯著(P > 0.05)

2.3根系微生物群落相似性研究

將土壤微生物PLFA生物標記按1或0統計(表2)后進行Jaccard′s相似性系數計算(數據略)，并基于相似性系數矩陣得到UPGMA聚類圖。聚類結果可以看出，有兩個明顯的組群與處理有關：第1組群以高氮添加(NH)為主，而第2個組群以單基因型(G1)種群為主，這一結果表明高氮添加(或物種基因型減少)會使地下部分微生物群落組成更相似。

圖3　不同處理的微生物群落PLFA生物標記聚類分析Fig.3　Cluster analysis of microbial PLFA biomarkers with different treatments

3　討論

植物多樣性(種間和種內)與氮添加的交互作用是否影響土壤微生物群落組成和結構的研究剛剛起步，Chung等[17]對美國明尼蘇達中東部天然草原以及Strecker等[18]對德國薩勒河附近一半天然草地的研究均未檢測到植物多樣性與氮添加交互作用對土壤微生物群落的組成和結構具有顯著影響，但Chung等研究發現植物物種多樣性和氮添加的交互作用對土壤凋落物分解過程中的兩個重要酶(β-葡萄糖苷酶和過氧化物酶)影響顯著，并分析這可能是通過凋落物生化性質的改變而發生的。本文以中國北方草原重要建群種羊草為研究對象，首次研究了植物種內基因型數目與氮添加的交互作用對土壤微生物群落組成和結構的及PLFA生物標記數量特征的影響，未檢測到羊草基因型數目與氮添加交互作用對土壤微生物總PLFA生物標記含量的顯著影響，這與前面提及的研究結果相似。但雙因素分析發現兩者的交互作用對細菌PLFA生物標記含量及真菌/細菌比具有顯著影響(表4)，即羊草基因型數目和氮添加交互作用對土壤微生物的組成和結構均具有顯著影響。這一結果與本研究為人工控制條件，所受干擾因素較少有關，也充分說明了羊草的多基因型效應受環境因素的影響顯著[21]。進一步簡單效應的分析結果顯示，在無氮添加處理下，基因型數目對微生物含量及真菌/細菌比影響顯著，而氮添加將限制這種影響(表4)；聚類分析結果中組群1以高氮添加處理組為主(圖2)，這些結果表明氮添加使得不同基因型數目羊草種群下土壤微生物群落的組成和結構更趨同，支持Wei等提出的在草原生態系統中，氮富集將弱化植物-微生物相互關系的觀點，這可能與氮添加使得土壤微生物生長從資源限制轉換為土壤酸性限制，減弱了植物碳對土壤微生物的限制，因而減弱了植物對土壤微生物的影響有關[31]。聚類分析結果中組群2以無氮和低氮添加下的單基因型羊草為主(圖2)，說明羊草種群基因型數目的減少也會使得地下土壤微生物群落的組成更趨同，但這種影響弱于高氮添加。

關于同種植物基因型數目與土壤微生物群落的組成和結構關系的研究剛剛起步，基于已有的物種多樣性與土壤微生物群落的組成及結構的研究[32-34]，對兩者間的關系作了以下推測：(1)隨著基因型數目的增加，植物輸入土壤的次生代謝物發生改變，從而引起土壤氮的可利用性發生變化，使得土壤微生物群落組成呈顯著的單峰曲線，這種關系在Schweitzer等對楊屬(Populusspp.)植物研究時已經被證實[13]。(2)由于基因型多樣性對種群生物量具有顯著的正效應，因此隨著基因型數目的增加種群生物量增加，相應的微生物量，特別是真菌含量增加。(3)植物生物量增加導致微生物量增加，進而使得植物與微生物間對土壤資源的競爭加劇而使得結果不確定。在本研究中，羊草基因型數目對所觀測的微生物群落含量組成和結構各變量均無顯著影響，這可能與氮添加的主效應有關(表4)；表3和圖1結果顯示，在無氮添加組，隨著基因型數目的增加，細菌PLFA生物標記的數量增加而真菌PLFA生物標記的數量減少，真菌/細菌比下降。總體上來看，植物基因型數目與微生物群落間的關系表現為不確定，支持推測(3)。

在全球變化的大背景下，大氣氮沉降對中國北方典型草原的影響已經被很多研究證實，氮添加能減少群落多年生禾草的數量、降低同種密度或基因型多樣性[19,35]。羊草作為中國北方典型草原區最重要的建群種，在維持群落生態系統功能方面具有重要作用。本研究結果表明群落建群種羊草基因型數目降低及高氮添加會使得土壤微生物群落更趨同，基因型數目與氮添加的交互作用對土壤微生物群落組成及結構具有顯著影響，這一研究結果不僅為全面理解植物多樣性與微生物群落結構和功能的關系提供數據補充，而且為氮沉降與基因型數目的交互作用如何影響土壤微生物群落的研究提供數據支持，對全球變化下生態系統進程的合理預測具有重要意義。

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Interactions between genotypic number and nitrogen addition on soil microbial communities in the population ofLeymuschinensis

XIN Xiaojing, LIU Lei, SHEN Junfang, ZHAO Nianxi*, GAO Yubao

CollegeofLifeScience,NankaiUniversity,Tianjin300071,China

Humans continue to transform the global nitrogen cycle at a record pace, through an increased combustion of fossil fuels, growing demand for nitrogen in agriculture and industry, and pervasive inefficiencies in its use, all of which has large impact on the health and processes in terrestrial and aquatic ecosystems worldwide. Studies on the effect of nitrogen addition on plant community showed that as the nitrogen input increases the biodiversity losses. Loss of biodiversity and increase in nitrogen inputs are two of the most crucial anthropogenic factors driving ecosystem processes. Both of them have received considerable attention in previous studies; however, information about their interactive effects on ecosystem function has been scarce. In particular, knowledge of how they interactively influence soil microbial communities and functions has been incomplete.Soil microbial communities can be affected directly by variations in the type, complexity, and amount of organic matter input to soils or indirectly via changes in the soil environment (e.g., soil moisture, temperature, and pH). Changes in any of these factors can influence physical and metabolic niche diversity in the soil, and therefore, may affect microbial diversity or composition. In recent years, the growing research has shown that genotypic diversity of dominant species has similar ecological effects as that of interspecific diversity in smaller species and relatively fragile ecosystems. Different genotypes vary in a multitude of traits including, but not limited to, growth rates, secondary metabolism, and physiological processes. Moreover, such variations have been shown to influence associated species (such as other plants, herbivores, soil microorganisms). Although only a few studies have tested the effects of genetic diversity on soil microbial communities, a few studies have shown that gene diversity inPopulusmay affect soil microbial communities and soil processes in ways similar to species diversity.Not only the number of species but also the density of the same species or genotypes decreased because of severe degradation in some areas of typical steppes of northern China. Atmospheric nitrogen deposition played an important role on plant diversity and soil microbial communities in the process of grassland degradation. Nitrogen addition has been proved to lead to a large reduction in species richness and loss of perennial grasses in mature communities of Inner Mongolia grasslands, and it was found that it reduces microbial diversity (e.g., functional diversity) in a semi-arid temperate steppe. In the present study, the effects of genotype number ofLeymuschinensis, nitrogen addition, and their interactions on the content and community structure of soil microbial communities were tested. The results are as follows. (1) Nitrogen addition had significant effects (P<0.05) on bacterial phospholipid fatty acid (PLFA) content, Shannon-Wiener diversity index, and Simpson dominance index. (2) The number ofLeymuschinensisgenotypes had no significant effect on observed variables (P> 0.05), but the interaction between the genotype number and nitrogen addition had a significant effect on bacterial PLFA content and fungal to bacterial ratios (P<0.05). These results provided the scientific data for the effects of nitrogen deposition and decrease in population size of important species on soil microbial community, and the exploration of community dynamics in a typical steppe of northern China in the context of global change.

genotypic number; nitrogen addition; microbial communities;Leymuschinensis

10.5846/stxb201506251289

國家自然科學基金項目(31570427)

2015-06-25;

2016-03-21

Corresponding author.E-mail: zhaonianxi@nankai.edu.cn

辛曉靜, 劉磊, 申俊芳, 趙念席，高玉葆.羊草基因型數目與氮添加對土壤微生物群落的交互影響.生態學報,2016,36(13):3923-3932.

Xin X J, Liu L, Shen J F, Zhao N X, Gao Y B.Interactions between genotypic number and nitrogen addition on soil microbial communities in the population ofLeymuschinensis.Acta Ecologica Sinica,2016,36(13):3923-3932.