厭氧銨氧化過程中關(guān)鍵酶及相關(guān)分子標(biāo)記在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

白　刃，賀紀(jì)正，沈菊培，陳　新，張麗梅,*

1 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，城市與區(qū)域生態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100085

2 中國科學(xué)院大氣物理研究所，大氣邊界層物理和大氣化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100029

3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京　100049

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厭氧銨氧化過程中關(guān)鍵酶及相關(guān)分子標(biāo)記在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

白刃1,3，賀紀(jì)正1，沈菊培1，陳新2，張麗梅1,*

1 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，城市與區(qū)域生態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085

2 中國科學(xué)院大氣物理研究所，大氣邊界層物理和大氣化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100029

3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049

厭氧銨氧化是由微生物介導(dǎo)的氮素循環(huán)過程中的重要途徑之一。近20年來，通過對厭氧銨氧化細(xì)菌生態(tài)學(xué)、基因組學(xué)和生理代謝特性的探索，人們對其微生物學(xué)機(jī)制已經(jīng)有了較多的認(rèn)識：厭氧銨氧化細(xì)菌通過亞硝酸鹽還原酶將亞硝酸根離子還原為一氧化氮，進(jìn)而與銨離子結(jié)合在聯(lián)氨合成酶的作用下生成聯(lián)氨，最后通過聯(lián)氨氧化酶的催化產(chǎn)生終產(chǎn)物氮?dú)狻Ｍ瑫r(shí)，對參與這些過程的關(guān)鍵酶及其功能基因的認(rèn)識有助于選擇新的分子標(biāo)記，從而為研究厭氧銨氧化細(xì)菌的多樣性和分子生態(tài)學(xué)特征提供新的工具，以彌補(bǔ)16S rRNA基因特異性相對較低且難以與生態(tài)功能關(guān)聯(lián)等方面的不足。對目前已知的參與厭氧銨氧化過程的3種關(guān)鍵酶的研究歷程和現(xiàn)狀進(jìn)行了評述，并總結(jié)了利用3種功能基因進(jìn)行厭氧銨氧化細(xì)菌生態(tài)學(xué)研究的最新進(jìn)展。

厭氧銨氧化作用；氮循環(huán)；酶；多樣性

圖1　厭氧銨氧化的主要過程[1]Fig.1　Main pathways of anammox[1]　d：距離; NirS：亞硝酸還原酶nitrite reductase；HZS：聯(lián)氨合成酶hydrazine synthase；HZO：聯(lián)氨氧化酶hydrazine oxidase；bc1：細(xì)胞色素bc1復(fù)合物cytochrome bc1complex

目前已知的厭氧銨氧化細(xì)菌主要包括5個(gè)屬CandidatusBrocadia,CandidatusKuenenia,CandidatusScalindua,CandidatusJettenia和CandidatusAnammoxoglobus[4-5]均屬于浮霉菌門(Planctomycetes)。由于厭氧銨氧化細(xì)菌難以培養(yǎng)，目前僅能獲得其富集培養(yǎng)物。對其多樣性及分布特征的研究主要是通過對環(huán)境樣品中16S rRNA基因序列的分析展開的。大量基于16S rRNA基因的調(diào)查表明，厭氧化銨氧化細(xì)菌廣泛分布于海洋、沉積物、淡水湖泊以及土壤生態(tài)系統(tǒng)中[6-8]。然而，由于目前厭氧銨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的PCR引物相對較低的特異性，及該基因與微生物功能活性相對較弱的關(guān)聯(lián)性等因素，限制了對厭氧銨氧化細(xì)菌多樣性及生態(tài)學(xué)功能的進(jìn)一步研究。近年來，隨著對幾個(gè)富集培養(yǎng)物的基因組學(xué)分析和酶學(xué)機(jī)制研究，及對參與厭氧銨氧化過程關(guān)鍵功能的酶如亞硝酸鹽還原酶(Nir)，聯(lián)氨合成酶(HZS)和聯(lián)氨氧化酶(HZO)及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)和揭示，使人們對于厭氧銨氧化過程的微生物代謝及遺傳機(jī)制也有了更深的認(rèn)識，從而使相關(guān)功能基因也逐步被作為厭氧銨氧化微生物的特異性標(biāo)記并用于其多樣性和生態(tài)學(xué)的研究中(表1)。

表1　厭氧銨氧化過程中關(guān)鍵酶的主要研究進(jìn)展Table 1　Research progress of key enzymes in anammox process

本文將就厭氧銨氧化過程中的幾種關(guān)鍵酶的主要研究進(jìn)展，以及各相關(guān)分子標(biāo)記在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜合評述。以期通過對厭氧銨氧化細(xì)菌研究的進(jìn)展進(jìn)行追蹤，為微生物生態(tài)學(xué)研究以及相關(guān)技術(shù)的研發(fā)提供有價(jià)值的信息。

1　參與厭氧銨氧化過程的關(guān)鍵酶

1.1亞硝酸鹽還原酶(Nir)

但更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，不同類群厭氧銨氧化細(xì)菌的亞硝酸鹽還原途徑可能存在明顯差異。比如，雖然能夠在K.stuttgartiensis中檢測到nirS基因，但該基因的mRNA表達(dá)水平很低，并且在其蛋白質(zhì)組氨基酸序列中幾乎檢測不到NirS[9]；與此相反，在CandidatusScalindua profunda(S.profunda)的基因組中，nirS是豐度最高的蛋白編碼基因之一[11]；但在與Jettenia屬有著較高同源性的菌種KSU-1中，只發(fā)現(xiàn)了nirK基因，而沒有檢測到nirS基因[13]。與此類似，在CandidatusBrocadia fulgida(B.fulgida)和CandidatusJettenia asiatica(J.asiatica)的宏基因組序列中同樣沒有檢測到與NirS相關(guān)的基因，并且僅在后者的基因組中發(fā)現(xiàn)了nirK基因[12,14]。Kartal等還猜測一些厭氧銨氧化細(xì)菌可能含有催化NO生成的其他同工酶，如對NH2OH和N2H4具有氧化功能的類羥氨氧化酶是可能的蛋白之一[9]。

1.2聯(lián)氨合成酶(HZS)

在基因簇kuste2859—2861編碼的蛋白中，kuste2859全部為β螺旋結(jié)構(gòu)，為HZS的催化位點(diǎn)提供了一個(gè)剛性平臺。kuste2860含有兩個(gè)c型細(xì)胞色素，推測其可能是催化反應(yīng)的活性中心。kuste2861蛋白的N-末端和C-末端分別由β螺旋和兩個(gè)c型細(xì)胞色素組成[9]。后來在B.fulgida[12]和J.asiatica[14]的基因組中也檢測到與kuste2859—2861高度相似的基因簇。在S.profunda細(xì)胞內(nèi)則發(fā)現(xiàn)了kuste2859—2861基因簇的直系同源基因，其中與kuste2861對應(yīng)的部分被命名為scal01318，而與kuste2859和2860對應(yīng)的部分則融合為一個(gè)整體并稱為scal00025[11]。從遺傳距離上看，HZS與細(xì)胞色素c過氧化物酶及色氨酸-色胺酰胺(TTQ，一種微生物的甲胺催化輔因子)生物合成酶有著較近的親緣關(guān)系[9]。

1.3聯(lián)氨氧化酶(HZO)

聯(lián)氨氧化酶(Hydrazine oxidase, HZO)的發(fā)現(xiàn)和功能的確定也經(jīng)歷了一個(gè)曲折且復(fù)雜的過程。1997年，van de Graaf等利用15N同位素標(biāo)記的方法證實(shí)了NH2OH和N2H4是厭氧銨氧化過程的中間產(chǎn)物，同時(shí)預(yù)測應(yīng)該存在對NH2OH和N2H4具有氧化活性的酶[17]。由于與好氧氨氧化微生物中的羥氨氧化酶(Hydroxylamine oxidase, HAO)有著相近的功能、結(jié)構(gòu)及編碼基因的序列和位置，厭氧銨氧化細(xì)菌的HZO在一段時(shí)間內(nèi)曾被認(rèn)為與好氧氨氧化過程中的HAO是等同的[16]，并在當(dāng)時(shí)的文獻(xiàn)中多被直接稱為HAO或類HAO蛋白(HAO-like protein)。

1998年，Schalk等發(fā)現(xiàn)厭氧銨氧化生物反應(yīng)器中的菌群對N2H4具有轉(zhuǎn)化能力，但單獨(dú)以N2H4為底物培養(yǎng)時(shí)厭氧銨氧化細(xì)菌無法生存[26]。他們后來又于2000年在B.anammoxidans的富集培養(yǎng)體系中分離純化出一種同時(shí)具有NH2OH和N2H4氧化活性的酶。該酶為三聚體，分子量183 kDa，含有26個(gè)血紅素。由于該種酶具有更強(qiáng)的NH2OH氧化能力，且與HAO有十分相似的活性特征，Schalk等將其歸為HAO[27]。但從氨基酸序列上看，該酶與真正的HAO存在著明顯差異[28]。Strous等通過對K.stuttgartiensis基因組序列的分析，同樣認(rèn)為厭氧銨氧化過程的HAO可能具有催化聯(lián)氨氧化生成氮?dú)獾墓δ埽⒃谠摶蚪M中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)與類HAO蛋白相關(guān)的基因[10]。人們隨后從S.profunda[11]、B.fulgida[12]和J.asiatica[14]的基因組中也發(fā)現(xiàn)與類HAO蛋白相關(guān)的直系同源基因簇，并進(jìn)一步推測這個(gè)基因簇與對NH2OH和N2H4的代謝有關(guān)聯(lián)。

2007年，Shimamura等從富集有菌株KSU-1的生物反應(yīng)器中分離純化出一種具有N2H4氧化活性但不具備NH2OH氧化能力的酶，將其正式命名為聯(lián)氨氧化酶(HZO)[16]。該酶由2個(gè)含8個(gè)血紅素的二聚體組成，分子量約62 kDa，與之前在厭氧銨氧化細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的HAO的結(jié)構(gòu)不同。通過基因組信息分析，他們還發(fā)現(xiàn)HZO分別由hzoA和hzoB兩個(gè)基因所編碼的。這兩個(gè)hzo基因的序列和好氧氨化細(xì)菌hao基因的相似度只有大約30%，但與K.stuttgartiensis中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)hao基因有著88%和89%的相似度。在隨后的研究中，Shimamura等進(jìn)一步從KSU-1中分離出一種和他們先前純化的HZO性質(zhì)不同，但與之前Schalk等從B.anammoxidans中分離的HAO相似的酶，該酶對NH2OH和N2H4同時(shí)具有氧化能力且對NH2OH的氧化活性更高。同時(shí)，這種酶對N2H4的氧化活性也低于KSU-1的HZO。更有趣的是，對基因序列的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，編碼該HAO的基因有著和KSU-1菌株hzoB基因相同的上游片段序列，顯示該HAO與HZO有較近的遺傳距離[23]。Klotz等進(jìn)而通過蛋白序列研究了HAO與HZO在演化生物學(xué)上的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這兩種酶均由反硝化細(xì)菌的硝酸鹽異化還原酶NrfA演化而來，且推測它們的出現(xiàn)與微生物體內(nèi)對NH2OH的解毒作用有關(guān)。他們認(rèn)為，雖然在系統(tǒng)發(fā)育分析上HAO與HZO可以分別聚成單獨(dú)的簇并各自具有一定的特性，但它們在功能上屬于同一種酶，其本質(zhì)上的區(qū)別只有在好氧氨氧化與厭氧銨氧化細(xì)菌體內(nèi)對NH2OH和N2H4進(jìn)行氧化時(shí)才有所表現(xiàn)[18,29]。近來，通過對多個(gè)厭氧銨氧化細(xì)菌的基因組序列比較，人們已經(jīng)鑒定了HAO/HZO基因簇中與N2H4的氧化相關(guān)的兩個(gè)基因kustc0694和kustd1340[14]，但HAO/HZO基因簇中其它各基因的功能及該基因簇在厭氧銨氧化過程中扮演的具體角色仍需要進(jìn)一步研究確定。

2　厭氧銨氧化細(xì)菌的分子標(biāo)記及其分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展

通過對厭氧銨氧化細(xì)菌的代謝機(jī)理及基因組學(xué)的研究，為人們理解其多樣性和生態(tài)學(xué)特征提供了重要的信息。目前， 16S RNA基因已經(jīng)廣泛被應(yīng)用于厭氧銨氧化細(xì)菌在各種生態(tài)系統(tǒng)中的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究中，并取得了豐富的成果。與此同時(shí)，越來越多的研究也開始利用具有更高特異性及多樣性的nirS，hzs和hzo基因。

2.116S rRNA基因

16S RNA基因是最早用于厭氧銨氧化細(xì)菌檢測的標(biāo)記基因，目前報(bào)道有多對引物可用于厭氧銨氧化細(xì)菌 16S RNA基因的擴(kuò)增，但各引物的覆蓋率和擴(kuò)增效率各有不同。如Penton較早比較了Brod541F/Brod1260R、Pla46/Amx0368等幾組引物對污水處理器中厭氧銨氧化細(xì)菌的檢測能力，發(fā)現(xiàn)Brod541F/Brod1260R對Scalindua屬具有特異性擴(kuò)增效果，而Pla46/Amx0368能檢測到全部厭氧銨氧化細(xì)菌；隨后Penton也針對多種生境進(jìn)行了引物比較，發(fā)現(xiàn)An7F/An1388R能成功擴(kuò)增3個(gè)屬的類群[30]；Dale通過發(fā)展了巢式PCR引物Pla46F/1037R和Amx368F/Amx820R，進(jìn)一步增強(qiáng)了對環(huán)境樣品PCR擴(kuò)增的效率[31]。最近，Li比較了幾組16S rRNA基因的PCR引物，發(fā)現(xiàn)Brod541F/Amx820R對海岸濕地、淺海和深海樣品中厭氧銨氧化細(xì)菌的陽性克隆檢測率最高(可達(dá)98%)，而在較早研究中使用的引物An7F/An1388R的檢測率則只有12%[32]；Han通過比較發(fā)現(xiàn)引物A438f/A684r對海洋、濕地、淡水水庫及生物反應(yīng)器等不同環(huán)境中的厭氧銨氧化細(xì)菌有更好的擴(kuò)增效果。可見，目前研究中對于厭氧銨氧化細(xì)菌16S rRNA基因PCR引物的選擇和應(yīng)用仍存在著較大的差異，引物之間的差異也可能導(dǎo)致研究結(jié)果產(chǎn)生一定的偏差(圖2)。

圖2　基于16S rRNA基因的厭氧銨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　Phylogenetic tree of anammox bacteria based on 16S rRNA genes

雖然不同的PCR擴(kuò)增引物有一定的偏向性，但大量基于16S rRNA基因分析的研究結(jié)果顯示，厭氧銨氧化細(xì)菌5個(gè)屬Brocadia,Kuenenia,Scalindua,Jettenia和Anammoxoglobus的分布有一定的生境特異性[33]。Scalindua屬主要分布于海洋生態(tài)系統(tǒng)中，同時(shí)它們在從陸地到海洋生態(tài)系統(tǒng)的過渡地帶中也有較高的豐度，而其它4個(gè)屬則主要在淡水和陸地生態(tài)系統(tǒng)中占到優(yōu)勢[34-35]。大量研究結(jié)果顯示，在使用不同16S rRNA基因引物的情況下，無論是在海水水域或底棲物中均發(fā)現(xiàn)Scalindua屬具有較高的多樣性和優(yōu)勢度，且檢測到的克隆子與已知的CandidatusScalindua sorokinii，CandidatusScalindua wagneri和CandidatusScalindua brodae有著較高的匹配度[30,32,36]。而在濕地、淡水河口生態(tài)系統(tǒng)的研究中， 5個(gè)屬的16S rRNA基因均可被檢測到，但以Brocadia屬，Kuenenia屬和Jettenia屬為主，且在不同研究中檢測到的優(yōu)勢類群也存在著較大差異[37-38]。如有研究表明，水稻田生態(tài)系統(tǒng)中能夠檢測到除Scalindua屬的其余4個(gè)屬的16S rRNA基因[39]，也有報(bào)道進(jìn)一步指出在所研究的32個(gè)農(nóng)田土壤中均未檢測到Scalindua屬，Brocadia和Kuenenia屬約則占了92%[40]。然而也有研究發(fā)現(xiàn)在中國東北地區(qū)的水稻土中厭氧銨氧化細(xì)菌主要是由Scalindua屬為主且具有較高的多樣性[41]。以上結(jié)果均暗示了陸地生態(tài)系統(tǒng)中厭氧銨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的多樣性和分布存在著較大的異質(zhì)性，其分布格局可能受到環(huán)境理化性質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)的分布和土壤類型等諸多因素的影響。

對16S rRNA基因的研究讓人們對厭氧銨氧化細(xì)菌的分類地位、多樣性和生態(tài)分布特征有了較為清晰的認(rèn)識。但對厭氧銨氧化細(xì)菌 16S rRNA基因的定量研究仍不理想，不同研究結(jié)果間可比性差。同時(shí)，由于16S rRNA基因與微生物生態(tài)功能之間較低的關(guān)聯(lián)性以及不同擴(kuò)增引物之間存在的偏差，仍然需要尋找更為有效的分子標(biāo)記[42]。因此，近年來越來越多的研究中開始使用3個(gè)重要的功能基因來檢測厭氧銨氧化細(xì)菌的多樣性、群落結(jié)構(gòu)及豐度。

2.2nirS基因

厭氧銨氧化細(xì)菌的nirS基因與反硝化細(xì)菌的nirS基因有著較高的分化程度和較遠(yuǎn)的遺傳距離，因此需要特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。Lam等首先基于CandidatusSchalindua的全基因組序列設(shè)計(jì)了針對該屬的nirS基因特異性引物Scnir372F/Scnir845R，并用該引物對秘魯海域最小含氧區(qū)(oxygen minimum zone, OMZ)進(jìn)行了研究[43]。結(jié)果顯示，通過該引物所檢測到的nirS基因序列均屬于Scalindua屬，且該基因的豐度與之前報(bào)導(dǎo)該海域中16S rRNA基因的豐度以及厭氧銨氧化細(xì)菌的細(xì)胞豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，并且nirS基因的表達(dá)量顯著高于反硝化細(xì)菌nirS基因的表達(dá)量，暗示在該生境中厭氧銨氧化細(xì)菌更占優(yōu)勢[43]。Jensen等對通過阿拉伯海OMZ中厭氧銨氧化細(xì)菌的細(xì)胞豐度、厭氧銨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的nirS基因表達(dá)量的研究也得到了類似的結(jié)果[44]。

Li等針對其它4個(gè)厭氧銨氧化細(xì)菌屬的nirS基因設(shè)計(jì)了特異性引物(AnnirS379F/AnnirS821R)，并同時(shí)使用Schalindua屬nirS特異性引物對中國東南沿海部分地區(qū)海洋生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行了研究[25]。作者發(fā)現(xiàn)該海域中厭氧銨氧化細(xì)菌nirS基因有較高的多樣性，并與16S rRNA基因和hzo基因的研究結(jié)果具有較好的一致性。該研究顯示nirS在聚類樹上形成Schalindua屬，Kuenenia屬和其他屬nirS基因3個(gè)分枝，且多數(shù)序列與秘魯海域和阿拉伯海域OMZ的Schalindua屬的nirS序列有較高的相似性，但與反硝化細(xì)菌nirS基因有顯著差異。其中，Schalindua屬的nirS分枝可以再細(xì)分為4個(gè)簇。通過主成分分析還發(fā)現(xiàn)，nirS基因的組成結(jié)構(gòu)隨NH4/NOx環(huán)境梯度發(fā)生明顯變化。Li等進(jìn)一步對我國南海中的Schalindua屬nirS基因的分類組成進(jìn)行了細(xì)致研究，發(fā)現(xiàn)該基因的豐度對環(huán)境因子的響應(yīng)和反硝化細(xì)菌nirS基因更為相似，與反硝化細(xì)菌的nirK基因明顯不同[45]。Kirkpatrick等對黑海的研究則發(fā)現(xiàn)，Schalindua屬nirS基因的4個(gè)簇均在5月、7月和10月間具有顯著不同的表達(dá)量，同時(shí)第2、3簇在不同水域深度中的分布較為平均，而第1簇集中分布在淺表層，第4簇主要分布在深層水域[46]。這些研究結(jié)果揭示了厭氧銨氧化細(xì)菌的高度多樣性及其與環(huán)境因子之間的密切關(guān)系。

目前有關(guān)厭氧銨氧化細(xì)菌nirS基因多樣性的研究仍然較少。同時(shí)根據(jù)前文的引述，并非所有厭氧銨氧化細(xì)菌類群均具有nirS基因，可見該基因不能單獨(dú)作為厭氧銨氧化細(xì)菌的特異性分子標(biāo)記，而應(yīng)該與nirK基因配合使用。考慮到Scalindua屬具有nirS基因并且在海洋中有著較高的豐度和多樣性，因此該基因在評估海洋生態(tài)系統(tǒng)厭氧銨氧化細(xì)菌的多樣性中有著相對較高的參考價(jià)值。

2.3hzs基因

聯(lián)氨合成酶(HZS)由hzsA，hzsB，hzsC基因簇編碼，目前尚未在其它微生物的基因組中發(fā)現(xiàn)該基因簇，因此hzs基因可以作為厭氧銨氧化細(xì)菌的特異性分子標(biāo)記用于多樣性和定量檢測研究。Harhangi等針對已知的5個(gè)屬的厭氧銨氧化細(xì)菌hzsA基因序列設(shè)計(jì)了引物(hzsA_526F/hzsA_1857R)及PCR反應(yīng)體系，并以來自廢水處理器和多種自然生境的樣本為模版對引物進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)來自廢水處理器樣本的hzsA基因序列與已報(bào)道的B.fulgida[47]，B.anammoxidans[7]，J.asiatica[48]的hzsA基因有著較高的相似度。在系統(tǒng)發(fā)育水平上，已知的厭氧銨氧化細(xì)菌hzsA基因與16S rRNA基因也有著很高的一致性[42]。

與16S rRNA的檢測結(jié)果類似，基于hzsA基因的研究結(jié)果也顯示海洋生態(tài)系統(tǒng)中厭氧銨氧化細(xì)菌主要是由Scalindua屬組成。如Borin等在地中海東部的深海中發(fā)現(xiàn)的hzsA基因全部屬于Scalindua屬[49]，Russ等在深海生態(tài)系統(tǒng)中也僅發(fā)現(xiàn)了屬于Scalindua屬的hzsA克隆，并且發(fā)現(xiàn)在烴釋放量較高的環(huán)境中該基因拷貝數(shù)更高[50]。Hu等研究了水稻土中hzsA的多樣性，發(fā)現(xiàn)其中的主要類群為Brocadia屬，同時(shí)也檢測到少量Jettenia和Anammoxoglobus屬的序列，但沒有發(fā)現(xiàn)Kuenenia屬的序列[51]。Wang等針對hzsB基因也設(shè)計(jì)了引物hzsB396F/hzsB742R，并利用該引物研究了水稻田土壤中hzsB基因的多樣性和豐度。結(jié)果同樣檢測到的類群主要屬于Brocadia屬，同時(shí)還檢測到若干未明確分類的簇，暗示hzsB基因可能具備更高的多樣性[52]。在Wang等利用同樣的引物對河口生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行的研究中，5個(gè)屬的序列均有發(fā)現(xiàn)，表明hzsB基因在河流生態(tài)系統(tǒng)中的多樣性可能比農(nóng)業(yè)土壤高[37]。

此外，Hu等利用該標(biāo)記對一些來自廢水處理反應(yīng)器的樣本進(jìn)行了定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)hzsA基因的拷貝數(shù)較之前研究過的16S rRNA基因拷貝數(shù)低3—6倍[53]，說明相對于16S rRNA基因，hzsA基因的引物可能有更高的特異性。在一個(gè)針對我國大部分地區(qū)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的研究中，Shen等發(fā)現(xiàn)hzsA基因的豐度在空間梯度上體現(xiàn)了較大的異質(zhì)性，并主要受土壤銨態(tài)氮的影響[40]。對土壤剖面的PCR分析結(jié)果顯示hzsB基因的豐度在剖面表層和深層中都相對較低，但在中等深度處(40—50 cm)最高[52]。

2.4hzo 基因

hzo基因負(fù)責(zé)編碼厭氧銨氧化細(xì)菌的聯(lián)氨氧化酶(HZO),目前已報(bào)道有多對針對該基因的引物被用于分子生態(tài)學(xué)研究。Quan等根據(jù)菌株KSU-1和K.stuttgartiensis的hzo基因序列首先設(shè)計(jì)了該基因的PCR引物hzoF1/hzoR1，并對幾個(gè)廢水處理生物反應(yīng)器中的厭氧銨氧化細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了研究[48]。發(fā)現(xiàn)通過該引物得到的氨基酸序列與KSU-1和K.stuttgartiensis的hzo基因的相似度在90%—98%之間。Schmid等通過對大量hzo基因序列進(jìn)行總結(jié)分析[54]，發(fā)現(xiàn)這些序列可以分為cluster Ⅰ，cluster Ⅱ，cluster Ⅲ 三個(gè)簇，其中cluster Ⅰ包含了KSU-1菌株，推測該簇中其它浮霉菌門的微生物也可能具有HZO的功能活性，并發(fā)現(xiàn)Anammoxoglobus屬和Jettenis屬與KSU-1的hzo基因有著較近的親緣關(guān)性。Li等以hzol1F1/hzocl1R2引物研究了17個(gè)高溫儲油罐中hzo基因的多樣性[28]，發(fā)現(xiàn)其中豐度最高的是Scalindua屬，此外，還檢測到Jettenia和Anammoxoglobus屬的序列。 Li等在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)了針對hzo基因的引物hzoF1/hzoR1并與之前的引物進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)新引物對多種生境中厭氧銨氧化細(xì)菌hzo基因的陽性檢測率更高[32]，且得到的氨基酸序列同樣可聚為cluster Ⅰ，cluster Ⅱ，cluster Ⅲ三個(gè)簇。同時(shí)cluster Ⅰ還可進(jìn)一步細(xì)分為subcluster Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ，其中subcluster Ⅰ和Ⅱ中的序列與菌株KSU-1，J.asiatica，以及Anammoxoglobus屬的hzo的氨基酸序列很高的相似度；而subcluster Ⅲ和Ⅳ中的序列則與Scalindua屬更接近。

相對于nirS和hzs基因，hzo更廣泛地被應(yīng)用于多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究中，且在系統(tǒng)發(fā)育水平上與對16S rRNA基因的研究結(jié)果有著較好的對應(yīng)性。基于hzo基因的分析同樣顯示了厭氧銨氧化細(xì)菌的分布具有生境特異性的顯著特點(diǎn)。Hirsch等對不同水生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hzo基因的多樣性組成在地下水、深海、河口及不同河流中有顯著差異。此外，hzo基因的多樣性比16S rRNA基因更高，暗示hzo基因可能是厭氧銨氧化細(xì)菌多樣性研究中更為有效的分子標(biāo)記[6]。Hong對hzo基因的研究發(fā)現(xiàn)，從中國南海采集的底棲物中檢測到的hzo基因全部屬于Scalindua屬[55]，而從南海濱海地帶的紅樹林區(qū)所采集底棲物中，除Scalindua屬以外，還檢測到Kuenenia屬，Brocadia屬和Jettenia屬的hzo基因序列[56]。Kong等使用針對2個(gè)hzo基因簇的特異性引物對哥斯達(dá)黎加海域的OMZ進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)hzo基因的表達(dá)量在表層中最高，尤其以cluster Ⅰ的hzo基因表達(dá)量更高。此外，大量hzo基因序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成一個(gè)新的簇(命名為cluster 2x)，與已知的厭氧銨氧化細(xì)菌hzo基因相距較遠(yuǎn)，而有關(guān)該簇更精確的分類學(xué)地位暫不明確[57]。此外，Wang等以hzo基因?yàn)闃?biāo)靶，在我國東北地區(qū)的水稻土中檢測到大量屬于Scalindua屬的hzo基因序列，這些Scalindua屬的序列占到主要優(yōu)勢且多樣性較高[41]，但該結(jié)果與基于16S rRNA基因調(diào)查得出的陸地生態(tài)系統(tǒng)中厭氧銨氧化細(xì)菌以Brocadia和Kuenenia兩個(gè)屬為主的結(jié)論差異較大[38-40](表2)。

表2　厭氧銨氧化細(xì)菌16S rRNA基因及功能基因的PCR引物Table 2　PCR primers of 16S rRNA and functional genes of anammox bacteria

3　結(jié)語與展望

綜上所述，在厭氮銨氧化細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)不到20a的時(shí)間里，人們對其多樣性、生態(tài)分布和發(fā)展相應(yīng)的分子標(biāo)記用于其生態(tài)學(xué)研究等方面都取得了較多的進(jìn)展，且通過酶學(xué)和基因組測序分析揭示了不同厭氧銨氧化細(xì)菌的代謝方式及其遺傳機(jī)理。但從以上綜述中也可看出，目前對厭氧銨氧化細(xì)菌的代謝途徑的理解大多停留在對于基因組數(shù)據(jù)分析的推測層面，一些關(guān)鍵基因的功能及其功能酶的生物化學(xué)特性仍有待進(jìn)一步確認(rèn)和驗(yàn)證。同時(shí)也有許多具體問題亟待解答：如各種酶在不同類群間是否存在結(jié)構(gòu)和代謝功能上的差異？厭氧銨氧化細(xì)菌的HAO在其代謝途徑中扮演了什么角色？它與HZO之間的具體關(guān)系是什么？有些厭氧銨氧化細(xì)菌體內(nèi)是否含有Nir的同工酶可以催化生成NO？

在分子生態(tài)學(xué)研究方面，雖然基于16S rRNA基因的研究為認(rèn)識厭氧銨氧化細(xì)菌的分類地位、多樣性及分布特征方面提供了重要信息，但該基因擴(kuò)增引物的代表性和特異性仍有待繼續(xù)驗(yàn)證，且由于與厭氧銨氧化細(xì)菌的真正功能活性缺乏直接的聯(lián)系，使該基因在進(jìn)行定量分析的研究中價(jià)值有限。新近發(fā)現(xiàn)的厭氧銨氧化細(xì)菌功能基因nirS、hzo、hzsA和hzsB，雖然在一定程度上彌補(bǔ)了16S rRNA基因的不足，但目前對功能基因的研究剛起步，針對這些基因擴(kuò)增的引物的特異性和有效性仍存在爭議。此外，16S rRNA基因研究結(jié)果顯示目前已知的厭氧銨氧化細(xì)菌僅分布于浮霉菌目的5個(gè)屬，而對nirS、hzo、hzsA和hzsB基因的研究顯示這些基因可能具有更高的多樣性。功能基因與16S rRNA基因所代表的微生物之間的聚類關(guān)系如何對應(yīng)，以及功能基因多樣性與其真正的生態(tài)功能之間如何關(guān)聯(lián)等問題尚不清晰。對這些問題的解答均需要大量的分子生態(tài)學(xué)和氮素生物地球化學(xué)調(diào)查及分析。

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Review of the key enzymes in the anammox process and ecological inferences derived from related molecular markers

BAI Ren1,3, HE Jizheng1, SHEN Jupei1, CHEN Xin2, ZHANG Limei1,*

1StateKeyLaboratoryofUrbanandRegionalEcology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China

2StateKeyLaboratortyofAtomosphericBoundaryLayerPhysicsandAtmosphericChemistry,InstituteofAtomsphericPhysics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100029,China

3UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China

Anammox (anaerobic ammonium oxidation) is a microbial-mediated pathway that plays an essential role in nitrogen cycling. Over the past twenty years, the characteristics of the anammox process and microbial metabolism have been determined by ecological, physiological, and genomic investigations. Anammox bacteria oxidize nitrite to nitric oxide via nitrite reductase, after which the nitric oxide further combines with ammonium to synthesize hydrazine, which is catalyzed by hydrazine oxidase to produce nitrogen gas. Functional genes encoding key enzymes in the anammox process have provided new molecular markers for ecological studies of anammox bacteria, and are potentially superior to 16S rRNA genes in linking anammox diversity to ecological functions. In this review, research on the key enzymes involved in the anammox process is introduced, and major advances in the molecular ecology of anammox bacteria are summarized based on functional gene investigations.

anammox; nitrogen cycling; enzyme; diversity

10.5846/stxb201411072209

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41090281, 41322007, 41203053)

2014-11-07; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015-10-30

Corresponding author.E-mail: zhanglm@rcees.ac.cn

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