HP感染的消化性潰瘍伴胃癌前病變與自噬因子的相關性研究

孔繁靜　趙　娟

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HP感染的消化性潰瘍伴胃癌前病變與自噬因子的相關性研究

孔繁靜趙娟

目的探討幽門螺桿菌(helicobacterpylori，HP)感染伴胃黏膜癌前病變與自噬因子LC3B表達水平之間的相關性。方法收集經胃鏡及黏膜下活檢確診為消化性潰瘍的患者263例，采用半定量RT-PCR方法檢測所有患者的自噬因子LC3B 表達水平，同時行碳14呼氣試驗進行HP檢測，分別比較患者的HP陽性檢出率與自噬因子LC3B表達水平之間的相關性；以及HP感染的消化性潰瘍伴胃癌前病變與自噬因子LC3B表達水平之間的相關度。結果自噬因子LC3B mRNA 高表達與HP檢出率呈正相關；自噬因子LC3B mRNA高表達與慢性胃炎伴不典型增生組的發病率呈正相關。結論自噬因子LC3B mRNA高表達與HP感染及消化性潰瘍伴胃黏膜不典型增生具有相關性。

幽門螺桿菌；自噬因子；LC3B；幽門螺旋桿菌檢測；胃癌前疾病

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.007

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1065～1068)

消化性潰瘍是臨床消化系統的常見性疾病，自從幽門螺旋桿菌發現以來，消化性潰瘍與其之間的關系已被證實，同時HP也是胃癌及胃癌前疾病的一個重要的發病因素，已有不少關于HP與胃癌及胃癌前疾病的研究[1-2]。HP感染的消化性潰瘍繼發的胃黏膜的損傷以及在此基礎上出現的一系列病理改變機制相當復雜，自噬是其中的一個重要的病理調控機制，在炎癥調控中扮演著雙重角色。自噬作用可以抑制性因子的激活，通過清除內源性刺激物降低炎性反應，同時在自噬缺失的情況下，內源性因子造成炎癥激活，增加炎性反應。自噬又是細胞降解細胞質中細胞器和蛋白質的主要途徑，長期以來細胞的自噬又被認為是細胞維持穩態的基礎，是細胞自救的行為，在各類炎性反應及腫瘤調控上自噬發揮著重要的作用。自噬泡膜上的微管相關蛋白1 輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3B) 是自噬的標志性分子，自噬活動在胃黏膜炎性損傷中被激活，同樣調控著胃黏膜的再生和愈合，自噬的分子機制也是當今消化界研究的熱點之一[3-4]。消化性潰瘍患者根除HP治療成為各大指南的強烈推薦意見，但是自噬調控與HP感染率以及胃癌前疾病的發病率之間的關系研究較少[3]。本研究通過對他們之間的相關性進行探討，分析自噬因子的表達水平與HP感染以及不同類型的胃癌前疾病之間關系，現報告如下。

1　材料與方法

1.1一般資料

收集納入了2014年1月至2015年5月期間的在我院消化科確診為消化性潰瘍的患者263例，其中男性148例，女性115例，平均年齡(46.25±10.23)歲，本研究經醫院倫理委員會批準，并簽署知情同意書。

1.2入組標準

所有納入本研究的患者均符合以下入組標準：①年齡在20～75周歲之間的患者；②均進行胃鏡檢查診斷為上消化道潰瘍，包括胃潰瘍、十二指腸球部潰瘍、復合性潰瘍，其中臨床表現為伴或不伴有活動性出血；③入院前1周內未服用過任何護胃藥及影響幽門螺旋桿菌檢查結果的藥物，包括抗生素及中藥，1個月內未服用過類固醇抗炎藥物；④患者沒有其他各類系統的嚴重疾病及腫瘤；⑤均順利完成胃鏡及鏡下取活檢術；⑥依從性好，并完成問卷調查。

1.3排除標準

出現以下情況予以排除：①年齡不滿20周歲，或大于75歲的患者；②有軀體性疾病或者其他系統疾病；③卓-艾氏綜合征、有胃手術史、胃癌、食管靜脈曲張破裂出血者予以排除；④存在聽力、視力疾病，意識不清或精神疾病，有服用過精神科藥物病史的患者；⑤有成癮類藥物及酒精使用史的患者。

1.4方法

1.4.1胃鏡檢查并取活檢對納入研究的患者行胃鏡檢查，并在檢查過程中發現患者存在消化性潰瘍，同時行鏡下取活檢術，病理組織放入福爾馬林液中待病理科行病理檢查，按照Forrest分級標準進行分級，記錄潰瘍的形態、大小等特征。

1.4.2碳14呼氣試驗對所有納入研究的患者在入組后給予空腹口服尿素14C膠囊，服藥30 min后對其進行呼氣試驗。應用幽門螺旋桿菌檢測儀(型號為：HUBT-01)進行HP檢測，在護理人員的配合下完成。

1.4.3染色方法對病理標本進行HE染色，采用常規的病理診斷及組織學分型分類分級。對判斷為HP陰性的采用Warthin-Starry細菌染色進行進一步確認HP的感染情況以判斷有無HP感染。

1.4.4HID-AB(pH2.5)-PAS黏液染色[5]唾液酸黏液染藍色，中性黏液染紫紅色，硫酸黏液染棕黑色。根據黏液染色及形態學標準定義各類胃癌前疾病：腸上皮化生，慢性萎縮性胃炎；胃上皮不典型增生。

1.4.5RT-PCR方法檢測自噬因子LC3B 表達水平對納入研究的患者的胃組織采用RNA提取試劑盒進行RNA提取，采用TaqMan RNA試劑盒檢測自噬因子LC3B表達情況。內參校正：RT-PCR反應每個樣本量取10 μl的RNA提取量，由于實驗測試過程中受到RNA逆轉錄效率、RNA濃度定量誤差以及每個樣品等體積的cDNA的含量不同等系統誤差的影響，我們采用RNU6作為實驗內參。對自噬因子LC3B的表達水平采用二步法進行檢測，第一步是通過莖環引物來合成互補DNA，再通過逆轉錄系統對10 ng RNA進行逆轉了反應體系進行反應，在PCR管加入10 μl的逆轉錄緩沖液，總的RNA濃度調整到2 ng/μl，最后加入5 μl的逆轉錄引物，在冰上混勻之后反應5 min，接著進行梯度變性反應，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min遞減。第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應體系，反應體系為2×的 PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman RNA的特異性引物，通過逆轉錄體系進行反應，cDNA共5 μl加入到RNA的去酶的水當中，將體積擴增至20 μl，通過循環反應94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min遞減的擴張40個循環之后，對實驗結果進行分析，采用實時定量反應，按照PCR操作說明，Ct的檢測值在20～32之外的需要進行第二次檢測。應用△Ct=Ct自噬因子LC3B-CtRNU6的計算公式計算自噬因子LC3B的相對表達量。

1.5統計學處理

所有采集的數據應用SPSS 21.0統計軟件全部數據建立數據文件，將LC3B表達水平分為2組，小于平均值為低表達組，大于平均值作為高表達組。通過分析LC3B的表達水平高低與發病相關因素分析以逐步回歸法篩選有統計學意義的變量，對臨床病理因素之間的風險情況采用logistic回歸分析，組間比較用方差分析，組間均數比較采用t檢驗，組間率的比較用卡方檢驗。應用Mann-whitney U檢驗法進行兩兩數據之間比較。具有統計學差異的以P<0.05表示。

2　結果

2.1LC3B的相對表達量與臨床特征之間的相關性

LC3B的相對表達量為0.436，95%CI為0.323～0.534，表達量低于平均值的有143例，高于平均值的有120例，LC3B相對表達量與患者的年齡、性別、發病的部位及黏膜損傷的大小并不存在相關性，P>0.05；而與HP感染、胃上皮不典型增生、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生有關(P<0.05)，見表1。

表1　LC3B的相對表達量與臨床特征的相關性

2.2LC3B相對表達量的高低與臨床因素之間的關系

采用logistic回歸分析LC3B相對表達量的高低與臨床因素之間的相關性，LC3B相對表達量與HP感染具有相關性，調整之后風險OR=5.05，95%CI為1.14～23.45，P=0.02，見表2。

表2　LC3B相對表達量的高低與臨床因素之間的關系

3　討論

消化性潰瘍是發生在胃十二指腸的急慢性潰瘍，是消化系統的常見病和多發病，其形成的原因具有多樣化的特點，酸性胃液對黏膜消化作用是消化性潰瘍形成的主要因素[6-8]。幽門螺旋桿菌是引發該病發生的主要環節，研究發現消化性潰瘍與HP感染密切相關。自從HP被發現以來，對上消化道的研究一直在不斷的更新和深入，HP通過損傷上消化道的黏膜層參與疾病的發生發展，且HP感染也是引起消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌前疾病甚至胃癌的重要因素，HP感染之后侵犯胃黏膜，使其黏膜屏障的免疫力下降，黏膜變薄且上皮細胞的類型也會發生改變，一些癌前疾病隨之發生，機體對HP的自我清除能力也下降，導致HP感染升高，相互影響也在一定程度上提高了上消化道腫瘤的發生率[9-11]。

自噬是多種組織細胞的保護機制，細胞通過降解而形成自噬體，運輸到溶酶體從而形成自噬溶酶體，并經過酶的降解消化之后實現某些細胞器的更新和新陳代謝。近年來研究結果顯示自噬貫穿在炎癥和黏膜損傷修復的整個過程，在胃黏膜的修復中扮演著一個十分重要的角色。自噬與胃黏膜的細胞修復及損傷的相關性是當今的研究熱點[12-13]。本研究納入243例消化性潰瘍的患者，入組后均行胃鏡檢查及胃鏡下活檢診斷并進行碳14尿素呼氣試驗方法檢測，所有納入研究的患者均采用半定量RT-PCR方法檢測自噬因子LC3B表達水平，同時行碳14呼氣試驗進行HP檢測，分別比較患者的HP陽性檢出率與自噬因子LC3B表達水平之間的相關性，以及HP感染的消化性潰瘍伴胃癌前病變與自噬因子LC3B表達水平之間的相關度。結果顯示，LC3B的相對表達量為0.436，95%CI為0.323～0.534表達量低于平均值的有143例，高于平均值的有120例，LC3B相對表達量與患者的年齡、性別、發病的部位及黏膜損傷的大小并不存在相關性；而與HP感染、胃上皮不典型增生、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生有關，結果提示自噬因子LC3B mRNA 高表達與HP檢出率呈正相關；自噬因子LC3B mRNA高表達與慢性胃炎伴不典型增生組的發病率呈正相關。HP感染后，導致胃酸對胃黏膜的損害，使胃黏膜細胞類型變化，腸上皮化生、萎縮性胃炎和不典型增生的胃癌前疾病發病會因為HP的感染導致胃酸分泌的抑制，同時HP感染會產生壁細胞的抑制蛋白，抑制胃酸分泌，因此自噬因子LC3B mRNA 高表達、HP感染及胃癌前疾病的發生三者是相互作用相互影響的。

綜上所述，本研究從自噬的角度對HP感染及胃癌前疾病進行臨床觀察，發現黏膜的不典型增生及HP感染與自噬因子LC3B mRNA 高表達存在密切關系，也初步證明了自噬因子LC3B mRNA高表達與胃癌前疾病確實存在著一定的相關性。本研究結果也提示自噬因子LC3B mRNA高表達對HP感染及胃癌前疾病具有調控作用，提示在胃黏膜惡化的形成過程中，自噬作為胃黏膜修復的重要機制，在治療中可選擇LC3B作為基因治療的靶點，本研究也為我們提供了基因治療的新思路。

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(編輯：甘艷)

Correlation between Precancerous Lesions and Autophagy Factor of HP Infectedwith Peptic Ulcer

KONGFanjing，ZHAOJuan.

JingzhouSecondPeople'sHospital，Jingzhou，434000

ObjectiveTo study the correlation between helicobacterpylori (HP) infection with gastric precancerous lesions and expression of autophagy factor LC3B.Methods263 cases of peptic ulcer patients confirmed by gastroenterology endoscopy and mucosal were selected，all patients included in the study received semi-quantitative RT-PCR method to detect self LC3B bite factor expression levels of carbon-14 breath test simultaneously perform HP detect correlations were compared in patients with HP positive rate of autophagy factor LC3B expression level；and former HP infection with gastric peptic ulcer disease autophagy factor LC3B correlation between the expression level.ResultsThe correlation of autophagy factor LC3B mRNA expression with HP detection rate was positive；autophagy factor LC3B mRNA expression in chronic gastritis with high incidence of dysplasia was positively correlated.ConclusionAutophagy factor LC3B mRNA expression with HP infection and peptic ulcer with gastric dysplasia are relevant.

Helicobacter pylori；Autophagy factor；LC3B；Helicobacter pylori detection；Precancerous disease

434000 湖北省荊州市第二人民醫院(孔繁靜)；441021 湖北省襄陽市中心醫院(趙娟)

趙娟

R735.2

A

1001-5930(2016)07-1065-04

2015-09-07

2016-01-11)