藥學(xué)本科中藥化學(xué)自主設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)實(shí)踐探索*

王　政，李春艷，劉　偉，董中云，沈頌章，蘇　娟

(1 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)，上海　200433；2 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，上海　200433)

?

藥學(xué)本科中藥化學(xué)自主設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)實(shí)踐探索*

王政1，李春艷1，劉偉1，董中云1，沈頌章2，蘇娟2

(1 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)，上海200433；2 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，上海200433)

為了讓學(xué)生更好的掌握中藥有效部位的制備和含量測(cè)定的方法和操作，開(kāi)展山楂葉總黃酮制備及含量測(cè)定的自主設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)教學(xué)以小組為單位進(jìn)行，學(xué)生查閱相關(guān)文獻(xiàn)，自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，并在老師指導(dǎo)下完善方案。小組合作完成山楂葉總黃酮的制備及含量測(cè)定后，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合理分析得出結(jié)論，提出進(jìn)一步的改進(jìn)方案，并對(duì)整個(gè)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程進(jìn)行總結(jié)和討論。

中藥化學(xué)；自主設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)；山楂葉總黃酮；制備；含量測(cè)定

中藥化學(xué)是藥學(xué)本科教育中一門(mén)必不可少的專業(yè)課，是藥學(xué)學(xué)科的重要組成部分。近年來(lái)，隨著中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化發(fā)展趨勢(shì)，中藥化學(xué)課程愈加重要。為了讓藥學(xué)學(xué)生在能夠綜合運(yùn)用所學(xué)理論知識(shí)的同時(shí)，熟練掌握中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能并應(yīng)用到實(shí)踐中，《中藥化學(xué)》授課期間開(kāi)展了自主設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)，以山楂葉總黃酮的制備和含量測(cè)定為實(shí)驗(yàn)任務(wù)，培養(yǎng)學(xué)生對(duì)實(shí)際問(wèn)題的探究能力和批判性思維，增強(qiáng)學(xué)生文獻(xiàn)查閱、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及團(tuán)隊(duì)合作等方面的能力，在教學(xué)實(shí)踐中提高學(xué)生的實(shí)踐能力和專業(yè)素養(yǎng)[1-2]。

1　實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩周，我們接到實(shí)驗(yàn)任務(wù)，通過(guò)查閱藥典和相關(guān)文獻(xiàn)，制定了設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，在老師的指導(dǎo)下完善方案后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)；最后結(jié)合實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)問(wèn)題分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以科研論文的形式遞交實(shí)驗(yàn)論文。

1.1文獻(xiàn)查閱及方案確定

本組成員共有4人，兩人查閱藥典及相關(guān)文獻(xiàn)資料。目前山楂葉的研究較為完善，文獻(xiàn)量較多，我們以山楂葉、總黃酮、制備和含量測(cè)定為關(guān)鍵詞檢索中文文獻(xiàn)，搜索范圍包括萬(wàn)方數(shù)據(jù)、重慶維普等，精選文獻(xiàn)作為參考[3-12]；交流討論后，初步擬定實(shí)驗(yàn)方案，與老師討論相關(guān)細(xì)節(jié)，對(duì)實(shí)驗(yàn)具體的操作步驟、所用溶劑等問(wèn)題進(jìn)行細(xì)化，使實(shí)驗(yàn)方案成為可操作的流程指導(dǎo)。

實(shí)驗(yàn)選擇滲漉法、超聲法為提取方法，選擇萃取法、大孔吸附樹(shù)脂法為分離方法，利用兩種提取方法和兩種分離方法，得到四組產(chǎn)品(甲組：滲漉法-萃取法；乙組：滲漉法-大孔吸附樹(shù)脂法；丙組：超聲法-萃取法；丁組：超聲法-大孔吸附樹(shù)脂法)。最后以藥典規(guī)定檢測(cè)山楂葉總黃酮含量的紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)四組產(chǎn)品進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2流程安排

整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為四組、三個(gè)部分，共分三次完成，實(shí)驗(yàn)流程如圖1。

圖1　山楂葉總黃酮制備流程

2　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1材料與儀器

材料：山楂葉；蘆丁對(duì)照品；石油醚；乙酸乙酯；蒸餾水；型大孔吸附樹(shù)脂(HP-20)；工業(yè)乙醇；5%亞硝酸鈉溶液；10%硝酸鋁溶液；氫氧化鈉試液。

儀器：電子天平(JY220)；萬(wàn)分之一天平(AL104)；超聲儀(HK6200)；滲漉筒；燒杯；錐形瓶(1000 mL)；圓底燒瓶(500 mL，1000 mL)；燒杯(500 mL)；玻璃棒；分液漏斗(250 mL)；旋蒸儀(NE6000-2)；載玻片；紫外分光光度計(jì)(Spectrumlab752Pro)；50 mL容量瓶；100 mL容量瓶。

2.2實(shí)驗(yàn)操作

2.2.1提取

滲漉法：取山楂葉適量，粉碎成粗粉，稱取山楂葉粗粉40 g，加入少量乙醇浸潤(rùn)，裝入滲漉筒，加入工業(yè)乙醇400 mL，浸泡3 h后，開(kāi)始滲漉，滲漉速度為5 mL/min，收集全部滲漉液，濃縮至約40 mL，分為甲、乙兩組，各約20 mL。

超聲法：取山楂葉適量，粉碎成粗粉，稱取山楂葉粗粉40 g，放入具塞的1000 mL錐形瓶中，加入工業(yè)乙醇400 mL，60 ℃超聲提取50 min，過(guò)濾后，減壓回收乙醇，濃縮至約40 mL，分為丙、丁兩組，各約20 mL。

2.2.2精制

萃取法：甲、丙兩組濃縮液中分別加入蒸餾水50 mL稀釋，加入石油醚40 mL，萃取，靜置分層后，分液，棄去石油醚層。水層中加入乙酸乙酯100 mL，共分三次加入，萃取，靜置分層后，分液，合并乙酸乙酯層，濃縮至干，得到黃褐色粉末，甲組得0.64 g，丙組得0.84 g。

樹(shù)脂法：取大孔吸附樹(shù)脂200 mL，平均分為兩份，分別裝柱。乙、丁兩組濃縮液分別上樣后，先用700 mL蒸餾水洗脫，棄去洗脫液；然后用500 mL 30%乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用500 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，得到黃褐色粉末，乙組得0.27 g，丁組得0.42 g。

2.2.3含量測(cè)定

2.2.3.1對(duì)照品溶液的配制

精密稱取蘆丁對(duì)照品20.1 mg，置100 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲處理溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取25 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。

2.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，在加水至刻度，搖勻，靜置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)(Y)，濃度(C)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=10.32X-0.018，r2=0.999

2.2.3.3提取物的含量測(cè)定

精密稱取山楂葉提取物約0.05 g，至50 mL量瓶中，加乙醇超聲溶解并定容至刻度，精密量取1.00 mL，置10 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加氫氧化鈉試液4.0 mL，搖勻，靜置15 min后加水至刻度，搖勻，依法測(cè)定吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得供試品溶液中黃酮類化合物的重量。

3　結(jié)果與討論

3.1結(jié)果

表1　山楂葉總黃酮不同制備方法及含量測(cè)定結(jié)果Table 1　The results of the different preparation methods and content determination of total flavonoids in Hawthorn leaves

3.2討論

本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取、分離方法所制備的四組產(chǎn)品的產(chǎn)率，結(jié)果以超聲法提取、萃取法分離得到的樣品產(chǎn)率和含量最高，經(jīng)過(guò)小組討論，可能的原因有：

(1) 提取方法的影響：產(chǎn)率和含量比較超聲法>滲漉法。滲漉提取法適合根莖類藥材的提取，對(duì)于莖葉類藥材的提取效果相對(duì)較差。

(2)分離方法的影響：產(chǎn)率和含量比較萃取法>樹(shù)脂法。樹(shù)脂法所得樣品的產(chǎn)率和含量主要取決于上樣量、樹(shù)脂的型號(hào)、洗脫溶劑的極性和體積，由于沒(méi)有對(duì)樹(shù)脂分離條件進(jìn)行探究，所選的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果可能有影響。

(3)含量測(cè)定方法：本實(shí)驗(yàn)采用2015版《中國(guó)藥典》一部“山楂葉”項(xiàng)下收載的紫外分光光度法對(duì)制備的山楂葉總黃酮樣品進(jìn)行含量測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)單，但專屬性較差，不能反映其中化學(xué)成分的情況。下一步會(huì)考慮采用HPLC-MS等專屬性更強(qiáng)的分析方法探明山楂葉總黃酮中化學(xué)成分種類及含量。

(4)參數(shù)優(yōu)化：由于課時(shí)的限制，我們未能對(duì)提取溶劑的極性、體積等因素進(jìn)行系統(tǒng)的探究。在之后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，可以考慮針對(duì)相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

4　結(jié)　語(yǔ)

山楂葉總黃酮提取及制備的自主設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)歷時(shí)近六周，通過(guò)實(shí)驗(yàn)方案的反復(fù)修訂、突發(fā)問(wèn)題的分析處理，我們的實(shí)驗(yàn)技能、團(tuán)隊(duì)協(xié)作、專業(yè)素養(yǎng)都得到了提升。在實(shí)踐中及時(shí)的發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、辯證的分析問(wèn)題、靈活的解決問(wèn)題是我們這次實(shí)驗(yàn)的最大收獲。在今后的學(xué)習(xí)中會(huì)我們更加注重自身能力的培養(yǎng)，不斷完善自我以適應(yīng)未來(lái)藥學(xué)工作的需要。

[1]朱蘭寸,金萍.天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)K實(shí)訓(xùn)與操作技能的培養(yǎng)[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2015,13(14):86-88.

[2]閻婷,于玲.天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中創(chuàng)新理念的應(yīng)用[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,12(4):73-75.

[3]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:32.

[4]韓曉璐,劉悅,聞俊,等.藥學(xué)本科藥物分析自主設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐探索[J].廣州化工,2014,42(15):230-232.

[5]于棟華,包順茹,于純淼,等.山楂葉總黃酮藥理作用研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,15(3):174-176.

[6]夏成凱,李靜,汪電雷.山楂葉總黃酮制備工藝參數(shù)的研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào),2014,11(3):78-81.

[7]蘭才.山楂葉總黃酮含量測(cè)定[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2013,29(9):1382.

[8]焦鐳,柴夢(mèng)穎,石明生,等.堿性條件下山楂葉總黃酮的提取工藝研究[J].北方園藝, 2014(8):128-130.

[9]任艷利,張維,劉影.準(zhǔn)噶爾山楂葉總黃酮的超聲波提取及抗氧化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(15):8710-8712.

[10]王肖,杜義龍,趙勝男,等.承德產(chǎn)山楂葉中總黃酮和5種黃酮類成分含量的動(dòng)態(tài)分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(17):171-175.

[11]孫君凱,王帥,包永睿,等.山楂葉黃酮類成分提取純化工藝研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,16(6):110-112.

[12]鄭賽利,許先芳,李蓮云,等.阿戈美拉汀的晶型制備表征及性質(zhì)研究——藥物多晶型綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2015,32(2):58-60.

Practice of Autonomous-designed Experiment of Natural Product Chemistry*

WANG Zheng1, LI Chun-yan1, LIU Wei1, DONG Zhong-yun1, SHEN Song-zhang2, SU Juan2

(1 Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433;2ExperimentalTeachingCenter,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

In order to help students to understand and practice the preparation and content determination of active extracts in natural products, an autonomous-designed experiment about total flavonoids in Hawthorn Leaves was implemented in Natural Product Chemistry teaching course. Students were divided into several groups to retrieve literatures, design the protocol and improve it with the teacher’s guide. After accomplishing the whole experiment including the preparation and content determination of total flavonoids in Hawthorn Leaves, the data was analyzed and came to a conclusion of the assay. Some suggestions were given on improving the quality and qualification of active extracts. In the end, the procedures of the designed experiment were summarized an discussed．

Natural Product Chemistry; autonomous-designed experiment; Hawthorn Leaves; preparation; content determination

中國(guó)高等教育學(xué)會(huì)藥學(xué)教育研究會(huì)資助課題(201419)。

王政(1995-)，男，藥學(xué)本科2013級(jí)學(xué)員。

蘇娟(1979-)，女，博士，副教授，主要從事中藥化學(xué)科研和教學(xué)工作。

R284

B

1001-9677(2016)014-0180-03