高危型HPV E2在宮頸癌細胞中的表達及其意義

丁文艷　鐘天鷹　高玲娟

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高危型HPV E2在宮頸癌細胞中的表達及其意義

丁文艷鐘天鷹高玲娟

宮頸癌是世界范圍內威脅女性健康的常見生殖道惡性腫瘤,人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染是導致宮頸癌及其相關病變的首要因素[1],組織學確診為侵襲性宮頸癌(ICC)的病例中,99.7% HPV DNA為陽性,其中HPV 16占51%,HPV 18占12.6%～25.7%[2]。研究揭示,高危型HPV E2作為一種反式調控因子,控制E6和E7基因的持續表達進而影響宮頸癌細胞的增殖[3],為進一步明確高危型HPV E2與宮頸癌的關系,我們在此探討高危型HPV E2在宮頸癌中的表達及其生物學意義。

1　材料與方法

1.1材料收集2009年3月至2013年2月間,于南京市婦幼保健院行宮頸癌手術患者的腫瘤組織30例,同時收集相應的癌旁正常宮頸組織(距腫瘤組織>5 cm)做為對照,置于液氮凍存備用。按年齡分為≥60歲的老年組與<60歲的非老年組。老年組12例,平均年齡(65.24±4.24)歲,非老年組18例,平均年齡(45.24 ± 3.87)歲。

1.2細胞培養宮頸癌細胞株SiHa由杭州赫貝生物公司提供。細胞接種于完全營養液中,每50 ml培養瓶中加入6 ml完全營養液(15%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 U/ml鏈霉素,以及非必需氨基酸10 ml/L,pH 7.2),置37 ℃,5%CO2培養箱內培養。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR，RT-PCR)PCR反應體系構成為20 μl，含0.1 μmol/L熒光標記探針、1×TaqMan Universal PCR Master Mix (ABI)、引物各0.2 μmol/L及DNA模板100～200 ng。ABI Prime 7300定量PCR檢測儀進行檢測，反應參數為：50 ℃/2 min，95 ℃/3 min，95 ℃/15 s，60 ℃/2 min，40個循環測試，單點熒光在60 ℃進行檢測。選擇FAM熒光檢測模式，每孔設3個復孔。采用以下公式進行計算實驗數據：2-△△CT=2-(CT.HPV E2- CT.actin)Time x + (CT. HPV E2- CT.actin)Time 0。

1.4質粒轉染及表達鑒定 轉染前24 h，宮頸癌細胞傳代至9孔培養板，每孔2.0 × 105個細胞。將宮頸癌細胞分為實驗組，轉染高危型HPV E2載體，對照組轉染空載體，空白組不經任何處理。用100 μl Opti-MEM稀釋1.6 μg質粒DNA，輕輕吹吸4次，室溫放置10 min。用100 μl Opti-MEM稀釋4.0 μl Lipofectamine，輕輕吹吸4次，室溫放置20 min。將質粒DNA和轉染試劑混合，室溫下放置30 min。將培養的宮頸癌細胞(80%)棄培養液，不完全營養液洗滌細胞5次；將混合液加入細胞上；于37 ℃ 5% CO2孵箱轉染6 h，換液，加入完全培養液，繼續培養24 h；轉染效率以熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達進行判斷，通過GFP的表達確定收獲細胞的最佳時段。

1.5宮頸癌組織的胞漿蛋白提取Western blot 提取宮頸癌組織的胞漿蛋白,取100 μg總蛋白上樣,采用等體積的1×loading buffer進行電泳,初始電壓為45 V,電壓達到65 V后,改用穩壓電泳。當目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上時,結束電泳實驗。濕法電轉移至PVDF膜,將膜置于封閉液中,室溫封閉2 h,放進含小鼠抗人高危型HPV E2單克隆抗體釋液中,搖床上37 ℃孵育2 h,TBST洗滌15 min×3次。將膜放進含抗小鼠IgG二抗稀釋液中,搖床上室溫孵育1 h,TBST滌15 min×3次。暗室中剪適合大小的膠片壓在膜上15 s,將膠片放入顯影液中反應1 min,取出滴干液體放入水中沖洗,放入定影液中定影5 s,自來水沖洗。

1.6MTT法(methyl thiazolyl tetrazolium，甲基噻唑基四唑)檢測細胞增殖活性收集對數期宮頸癌細胞，調整細胞濃度至6 ×105/ml，將細胞懸液接種于96孔板，5% CO2、37 ℃培養箱內培養48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20μl MTT，37 ℃培養4 h。加入1 M的DMSO 150 μl，低速震蕩15 min，充分溶解結晶物。OD 490 nm波長，酶聯免疫檢測儀讀取吸光度(A)值。以公式：細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.7流式細胞儀檢測宮頸癌細胞凋亡率 胰酶消化對數期生長的宮頸癌細胞，收集各組細胞，調整其濃度至5 ×106/ml。500～1000 r/min離心10 min，棄去培養液。用預冷，4 ℃無菌的PBS充分洗滌細胞3次，用200 μl結合緩沖液重新懸浮細胞。加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl 的PI溶液，室溫下，避光孵育30 min。將試管置于冰上，與Annexin V-FITC/PI孵育10 min后，流式細胞儀檢測宮頸癌細胞凋亡情況。

2　結果

2.1高危型HPV E2在宮頸癌和癌旁正常組織中的表達水平RT-PCR結果顯示,癌旁正常組織中高危型HPV E2 mRNA的表達(0.87± 0.31)顯著增高,但其相對應的宮頸癌組織中高危型HPV E2 mRNA的表達明顯減少(0.35 ± 0.16),差異有統計學意義(P<0.01)。Western blot檢測高危型HPV E2蛋白的表達水平表明,宮頸癌組織中高危型HPV E2蛋白明顯減少(0.26 ± 0.12),與相應的宮頸癌旁正常組織(0.74 ± 0.36)比較差異有統計學意義(P<0.01)。其中,老年組高危型HPV E2(0.28 ± 0.14)在宮頸癌組織中的表達顯著低于非老年組(0.76 ± 0.29)(P<0.01)。

2.2高危型HPV E2對宮頸癌細胞株SiHa增殖及凋亡的影響采用MTT檢測轉染高危型HPV E2質粒,對宮頸癌細胞株SiHa增殖的影響,高危型HPV E2組,其細胞存活率與PBS組比較,差異具有統計學意義(P<0.01),但空載體組與PBS組比較差異無統計學意義(P>0.05)。宮頸癌細胞的凋亡情況,高危型HPV E2組,其凋亡細胞數與PBS組比較顯著增加,差異有統計學意義(P<0.01),但空載體組與PBS比較,其差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

項目高危型HPVE2空載體PBS存活率24±4**78±882±9凋亡率83±9**28±331±4

注:與PBS組比較,**P<0.01

3　討論

世界上宮頸癌新發病例47萬例/年,其中中國占新發病例總數的28.8%[4]。宮頸癌的病因學研究已經證實,高危型HPV感染是導致宮頸癌及其相關病變的重要因素[5],因此深入探索高危型HPV感染對宮頸癌發生發展的影響成為預防醫學領域疾病早期防治的一個熱點研究內容。

國際癌癥研究機構(IARC)調查顯示,宮頸癌在中老年婦女發生率較高,與年輕婦女相比,其也有較高的死亡率。高危型HPV16、18型與宮頸癌的發生密切相關,其感染宮頸上皮的基底細胞和基底周圍細胞后,其基因片段或者整個DNA可以整合到宿主細胞基因組中。早期編碼區(early region,E區)起始編碼E1、E2、E5、E6、E7蛋白,其中高危型HPV E2、E6、E7基因與HPV致瘤密切相關[6]。本研究結果揭示:不僅宮頸癌組織中高危型HPV E2基因明顯少于相應的宮頸癌旁正常組織,而且老年組高危型HPV E2在宮頸癌組織中的表達顯著低于非老年組,表明老年人宮頸癌的高發生率與致死率與高危型HPV E2表達有密切的相關性。

研究揭示,高危型HPV E2既調節病毒的轉錄又調節病毒的復制,且通過多種途徑影響細胞的生物學特性。作為一種反式調控因子,其可通過控制E6和E7基因的持續表達影響宮頸癌細胞的增殖[7],可通過調控p53和pRB蛋白誘導宮頸癌細胞凋亡[8]、也可通過引發線粒體功能障礙導致宮頸癌細胞凋亡[9]。本研究結果揭示,高危型HPV E2可顯著抑制宮頸癌細胞的增殖活性,導致宮頸癌細胞的凋亡效應。以上結果提示,高危型HPV E2在宮頸癌細胞中的低表達,使腫瘤細胞逃避凋亡得以發生無限增殖。如果將高危型HPV E2作為宮頸癌治療的潛在靶點,進而尋找有效高危型HPV E2表達的新療法,從而提高傳統宮頸癌療法的效果具有重要的臨床意義。

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南京市醫學科技發展基金(YKK14123)

210004江蘇省南京市,南京醫科大學附屬南京婦幼保健院檢驗科

高玲娟，Email：gaolingjuan@njmu.edu.cn

R 737.33

Bdoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.03.021

2015-05-21)