血小板C型凝集素樣受體-2與血栓性疾病研究進展

王浩　駱雷鳴

?

血小板C型凝集素樣受體-2與血栓性疾病研究進展

王浩駱雷鳴

王浩　教授

血小板黏附、激活及聚集在暴露的內皮下細胞外基質(extracellular matrix,ECM)是止血過程必不可少的步驟。此步驟涉及多個環節及多個血小板受體-配體反應。其中,血小板黏附反應主要涉及的受體為血小板糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib-V-IX復合物與整合素,激活與聚集反應主要涉及GPVI及C型凝集素樣受體-2(C-type lectin-like receptors-2, CLEC-2)[1-3]。

CLEC-2是近年發現的在血小板表面表達的信號受體,在最初通過生物信息學技術鑒定CLEC-2之后,利用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及印跡雜交(northern blot)分析技術發現CLEC-2 mRNA在肝臟細胞、多種造血細胞(包括單核細胞、樹突細胞、NK細胞及粒細胞)中有表達[4]。后來發現CLEC-2蛋白在人類血小板、巨核細胞系、肝竇內皮細胞、肝臟枯否細胞均有表達[5-6]。相比而言,CLEC-2在血小板和巨核細胞內相對特異表達,而在其他類型細胞內表達水平較低[7]。既往研究發現,CLEC-2激活后可以誘導血小板聚集。本文就CLEC-2與血栓性疾病的研究進展綜述如下。

1　結構與信號轉導

CLEC-2是在研究蛇毒蛋白(rhodocytin)引起凝血及血栓形成的血小板受體時鑒定出來的。Rhodocytin依賴Src家族激酶激活血小板,但并不依賴膠原受體GPVI/FcRγ鏈復合物,而后者是已知經典的依賴Src激酶激活血小板的受體途徑[8],所以推測有另一種受體途徑介導了rhodocytin所誘導的血小板聚集作用。最終應用rhodocytin親和色譜法及質譜分析法確定CLEC-2是rhodocytin在血小板表面的受體[3]。

CLEC-2是一種32～40 kDa的Ⅱ型跨膜受體,攜帶一個C型凝集素樣結構域。C型凝集素通過碳水化合物識別域以一種鈣離子依賴模式與碳水化合物結合,而CLEC-2屬于非典型的C型凝集素樣蛋白,同樣含有與碳水化合物識別域同源的C型凝集素樣結構域,但是缺乏與糖和鈣離子結合的共有序列[4]。CLEC-2是凝集素受體家族第一個通過酪氨酸激酶依賴途徑刺激血小板聚集的成員。

CLEC-2 的信號轉導主要利用FcRγ的胞漿側尾部的免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)[9],每個ITAM包含2個保守的YXXL序列,由6～12個氨基酸分開,rhodocytin與CLEC-2發生配體受體反應后使YXXL磷酸化,與Syk的串聯SH2結構域結合,引發激酶活化。CLEC-2擁有單個YXXL,其可以通過2個磷酸化的受體之間通過串聯的SH2結構域進行橋接形成二聚體,1個Syk的串聯SH2結構域與2個分子的磷酸化的YXXL以2:1形式結合[10-11],而后激活Syk。CLEC-2激活Syk后啟動適配體及效應蛋白信號級聯反應,下游信號分子與GPVI一致,包括LAT、SLP-76、Vav1/3的酪氨酸磷酸化,效應蛋白包括Btk及磷脂酶Cγ2 (phospholipase Cγ2, PLCγ2)[12],并最終激活PLCγ2并募集PLCγ2至細胞膜[13-14]。人類血小板CLEC-2的激活嚴格依賴ADP、血栓素A2(thromboxane A2, TxA2)及肌動蛋白聚合的反饋反應[15]。另外,CLEC-2通過調節PI3K及PKC的下游信號分子Akt及MAPK,引起糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase,GSK)3α/β的磷酸化及抑制,增強血小板聚集及分泌[16]。CLEC-2信號轉導途徑見圖1[17]。

目前唯一已知的CLEC-2內源性配體是podoplanin,在脈管系統外的多種細胞表達[18]。Rhodocytin是CLEC-2外源性配體,是一種強力血小板激活蛋白,由馬來亞蝮蛇分離獲取[3]。另外,鹽藻多糖作為血友病的治療藥物,可以激活血小板,縮短血友病患者出凝血時間,其激活血小板功能在CLEC-2敲除的小鼠血小板被抑制,提示鹽藻多糖是一種新型CLEC-2激動劑[19]。

圖1　CLEC-2信號轉導途徑

一種新型非細胞毒的5-硝基苯甲酸鹽化合物2CP是目前第一個確定的血小板CLEC-2拮抗劑[20],其利用與podoplanin相同的結合單元直接競爭性結合CLEC-2,抑制podoplanin誘導的血小板激活。

CLEC-2的下游信號轉導還可能與雙重特異性磷酸酶3(dual-specificity phosphatase 3,DUSP3)有關[21]。DUSP3在人和小鼠血小板高度表達,在DUSP3缺陷的小鼠的血小板,由膠原受體糖蛋白VI和CLEC-2介導的血小板聚集和顆粒釋放反應選擇性受損。與野生型小鼠相比,DUSP3缺陷的小鼠更加不易發生膠原和腎上腺素誘導的血栓形成。在分子水平,DUSP3缺陷抑制了Syk酪氨酸磷酸化,隨后抑制了PLCγ2磷酸化和鈣離子流動,從而抑制了血小板激活。

2　與血栓性疾病關系研究

由于CLEC-2潛在的血小板活化作用,推測其可能成為抗血栓藥物的靶點[22],但是CLEC-2敲除小鼠的致命性,使得關于該受體在凝血及血栓形成中的功能研究變得非常困難。第一項直接涉及此問題的研究,是通過抗體來免疫耗竭小鼠血液循環中的CLEC-2完成的,靜脈內注射單克隆抗CLEC-2 IgG抗體INU1 可導致血小板表面受體下調超過6 d[23]。 與抗體(JAQ1)介導的GPVI下調類似,血小板計數在4 d后恢復,新生血小板缺乏CLEC-2[24],CLEC-2耗竭的血小板對rhodocytin無反應,這種缺陷高度特異,因為血小板對于所有其他檢測用激活劑的激活和聚集反應均無變化[23]。很快,有團隊在CLEC-2缺陷的嵌合子小鼠的造血系統內,報道了同樣確切的反應缺陷[25]。進一步揭示了CLEC-2對于穩定血小板聚集的重要作用。

在全血液灌注分析中,CLEC-2耗竭的血小板能夠正常黏附在膠原覆蓋的表面,但隨即穩定的聚集形式在中到高的剪切率時遭到嚴重破壞。在氯化鐵所致的腸系膜動脈損傷在體模型中,亦可見到血栓穩定性缺陷,證據是正常血小板可黏附在損傷的血管壁,但是CLEC-2耗竭的血小板卻阻礙了血栓形成過程[22]。與此一致,Suzuki-Inoue 等描述了CLEC-2缺陷的血小板如預期一樣對Rhodocytin無反應,但對經典的血小板激活劑如膠原、凝血酶及ADP等誘導血小板聚集有正常反應,包括對膠原、層粘連蛋白及纖維蛋白原等不同基質的黏附反應亦正常,然而CLEC-2嵌合體血小板在血栓形成方面發生了障礙,聚集穩定性出現了異常[25]。基于這些結果,可以推測CLEC-2通過“接手”GPVI的血小板募集功能推動血栓生長,與膠原接觸無關。利用抗體同時阻斷GPVI及CLEC-2可使凝血功能發生障礙,動脈內血栓形成嚴重受阻[26]。然而,與這些研究相反,其他學者在體外研究中發現CLEC-2耗竭的血小板聚集功能正常[27]。出現這些矛盾結果的原因暫不明。 CLEC-2在止血過程中似乎扮演了一個小角色,因為在部分血小板存在CLEC-2缺陷的的小鼠,出血時間沒有延長或者僅僅中度延長[23]。

既往推測血小板(hem)ITAM、GPVI 及CLEC-2幾種受體之間可以互相補償以防止失血[3],因為有些缺乏GPVI的患者和小鼠只是表現出很輕微的出血傾向[28]。這個問題非常重要,因為涉及到在對有(hem)ITAM信號轉導途徑有部分缺陷的患者進行針對其他各自的(hem)ITAM受體治療時,可能引起不可控制的出血。目前涉及血小板之間交互作用的CLEC-2的生理配體尚不明了。推測其可以在活化的血小板上表達或固定[23]。有團隊推測CLEC-2的親同種抗原交互作用可能在此發揮作用[25],但這種觀點亦被其他人所質疑。

因為血小板的激活在血栓形成中至關重要,因此檢測在體血小板激活對于鑒定病人是否處于血栓風險及監測抗血小板治療效果有重要意義[29]。利用酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測個體血漿中可溶性CLEC-2(soluble CLEC-2,sCLEC-2)濃度,結果發現,10名健康個體平均濃度為(97 ± 55) pg/ml,同時25例糖尿病患者為(149 ± 260) pg/ml,糖尿病患者有升高趨勢,可能反映了在體血小板激活情況,提示sCLEC-2作為在體血小板激活情況的生物標記物有重要臨床意義。

3　展望

因為CLEC-2缺陷小鼠在影響血栓形成的同時沒有明顯增加出血傾向,推測CLEC-2可能是抗血小板藥物的一個良好的靶點,安全性更高。因此,進一步深入研究CLEC-2將對動脈血栓的治療和預防提供新的思路。

[1]Savage B, Almus-Jacobs F, Ruggeri ZM. Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombus formation under flow[J].Cell,1998, 94(5): 657-666.

[2]Inoue O, Suzuki-Inoue K, McCarty OJ, et al. Laminin stimulates spreading of platelets through integrin alpha6beta1-dependent activation of GPVI[J].Blood, 2006, 107(4): 1405-1412.

[3]Suzuki-Inoue K, Fuller GL, Garcia A. A novel Syk-dependent mechanism of platelet activation by the C-type lectin receptor CLEC-2[J].Blood,2006,107(4):542-549.

[4]Colonna M, Samaridis J, Angman L. Molecular characterization of two novel C-type lectin-like receptors, one of which is selectively expressed in human dendritic cells[J].Eur J Immunol， 2000,30(5):697-704.

[5]Chaipan C, Soilleux EJ, Simpson P, et al. DC-SIGN and CLEC-2 mediate human immunodeficiency virus type 1 capture by platelets[J].J Virol, 2006,80(18): 8951-8960.

[6]Tang T, Li L, Tang J, et al.A mouse knockout library for secreted and transmembrane proteins[J].Nat Biotechnol,2010, 28(6):749-755.

[7]Kerrigan AM, Dennehy KM, Mourao-Sa D, et al. CLEC-2 is a phagocytic activation receptor expressed on murine peripheral blood neutrophils[J].J Immunol,2009, 182(7): 4150-4157.

[8]Suzuki-Inoue K, Ozaki Y, Kainoh M, et al. Rhodocytin induces platelet aggregation by interacting with glycoprotein Ⅰa/Ⅱa (GPⅠa/Ⅱa, Integrin alpha 2beta 1). Involvement of GPⅠa/Ⅱa-associated src and protein tyrosine phosphorylation[J].J Biol Chem,2001, 276(11):1643-1652.

[9]Watson SP, Herbert JM, Pollitt AY. GPVI and CLEC-2 in hemostasis and vascular integrity[J].J Thromb Haemost, 2010, 8(2):1456-1467.

[10]Watson AA, Christou CM, James JR, et al. The platelet receptor CLEC-2 is active as a dimer[J].Biochemistry,2009, 48(66): 10988-10996.

[11]Hughes CE, Pollitt AY, Mori J, et al. CLEC-2 activates Syk through dimerization[J].Blood, 2010, 115(12): 2947-2955.

[12]Fuller GL, Williams JA, Tomlinson MG, et al. The C-type lectin receptors CLEC-2 and Dectin-1, but not DC-SIGN, signal via a novel YXXL-dependent signaling cascade[J].J Biol Chem, 2007, 282(23):12397-12409.

[13]Severin S, Pollitt AY, Navarro-Nunez L,et al. Syk-dependent phosphorylation of CLEC-2: a novel mechanism of hem-immunoreceptor tyrosine-based activation motif signaling[J].J Biol Chem,2011,286(6):4107-4116.

[14]Hughes CE, Auger JM, McGlade J, et al. Differential roles for the adapters Gads and LAT in platelet activation by GPVI and CLEC-2[J].J Thromb Haemost,2008, 6(12): 2152-2159.

[15]Pollitt AY, Grygielska B, Leblond B, et al. Phosphorylation of CLEC-2 is dependent on lipid rafts, actin polymerization, secondary mediators, and Rac[J].Blood, 2010, 115(20): 2938-2946.

[16]Moroi AJ,Watson SP. Akt and mitogen-activated protein kinase enhance C-type lectin-like receptor 2-mediated platelet activation by inhibition of glycogen synthase kinase 3α/β[J].Thromb Haemost, 2015,13(6): 1139-1150.

[17]Suzuki-Inoue K. Essential in vivo roles of the platelet activation receptor CLEC-2 in tumour metastasis, lymphangiogenesis and thrombus formation[J].J Biochem, 2011,150(2):127-132.

[18]Astarita JL, Acton SE, Turley SJ. Podoplanin: emerging functions in development, the immune system, and cancer[J].Front Immunol, 2012,3: 283.

[19]Manne BK, Getz TM, Hughes CE, et al. Fucoidan is a novel platelet agonist for the c-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) [J].J Biol Chem， 2013,228(11):7717-7726.

[20]Chang YW, Hsieh PW, Chang YT, et al. Identification of a novel platelet antagonist that binds to CLEC-2 and suppresses podoplanin-induced platelet aggregation and cancer metastasis[J].Oncotarget, 2015,6(40):42733-42748.

[21]Musumeci L, Kuijpers MJ, Gilio K, et al. Dual-specificity phosphatase 3 deficiency or inhibition limits platelet activation and arterial thrombosis[J].Circulation，2015,131(6):656-668.

[22]O’Callaghan CA. Thrombomodulation via CLEC-2 targeting[J].Curr Opin Pharmacol,2009,9: 90-95.

[23]May F, Hagedorn I, Pleines I, et al. CLEC-2 is an essential platelet-activating receptor in hemostasis and thrombosis[J].Blood, 2009, 114(22): 3464-3472.

[24]Nieswandt B, Schulte V, Bergmeier W, et al. Longterm antithrombotic protection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice[J].J Exp Med,2001,193(4): 459-469.

[25]Suzuki-Inoue K, Inoue O, Ding G, et al. Essential in vivo roles of the C-type lectin receptor CLEC-2: embryonic/neonatal lethality of CLEC-2-deficient mice by blood/lymphatic misconnections and impaired thrombus formation of CLEC-2-deficient platelets[J].J Biol Chem 2010,285(32):24494-24507.

[26]Bender M, May F, Lorenz V, et al. Combined in vivo depletion of glycoprotein vi and c-type lectin-like receptor 2 severely compromises hemostasis and abrogates arterial thrombosis in mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013,33(7):926-934.

[27]Hughes CE, Navarro-Nunez L, Finney BA, et al. CLEC-2 is not required for platelet aggregation at arteriolar shear[J].J Thromb Haemost, 2010,8(10): 2328-2332.

[28]Boylan B, Chen H, Rathore V, et al. Anti-GPVI-associated ITP: an acquired platelet disorder caused by autoantibody-mediated clearance of the GPVI/FcR gamma-chain complex from the human platelet surface[J].Blood,2004,104(9): 1350-1355.

[29]Kazama F, Nakamura J, Osada M, et al. Measurement of soluble C-type lectin-like receptor 2 in human plasma[J]. Platlet,2015, 26(8): 711-719.

100853北京市,中國人民解放軍總醫院南樓心內科

R 543.31

Adoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.03.004

2016-01-15)