銀杏葉提取物對糖尿病大鼠視網膜病變的作用

杜 倩， 田秋霞， 付莉萍， 李劍波

(南陽市中心醫院眼科，河南南陽473000)

銀杏葉提取物對糖尿病大鼠視網膜病變的作用

杜 倩△， 田秋霞， 付莉萍， 李劍波

(南陽市中心醫院眼科，河南南陽473000)

目的:研究銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)對大鼠糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)的影響及初步機制。方法:實驗共分為5組，以普通Wistar大鼠作為正常對照組(control組)、Goto-Kakizaki(GK)大鼠作為糖尿病視網膜病變模型組(DR組)，給予GK大鼠不同劑量的銀杏葉提取物，分為低劑量組(GBEL組)，中劑量組(GBE-M組)和高劑量組(GBE-H組);檢測各組大鼠的血糖與血-視網膜屏障損傷情況;TUNEL染色法和Western blot法分別檢測視網膜組織的神經節細胞凋亡情況，核子因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、磷酸化細胞外調節蛋白激酶 (phosphorylation-extracellular regulated protein kinase，p-ERK)、細胞外調節蛋白激酶總蛋白(total extracellular regulated protein kinase，t-ERK)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和P53的蛋白水平變化。結果:銀杏葉提取物能夠降低糖尿病視網膜病變大鼠的血糖，減輕血-視網膜屏障的損傷，并降低視網膜神經節細胞凋亡數，上調細胞內的Nrf2、p-ERK與Bcl-2的蛋白水平，下調P53的蛋白表達，而對t-ERK蛋白的表達水平無顯著影響。結論:在糖尿病視網膜病變中，銀杏葉提取物能有效地保護視網膜神經節細胞，可能與Nrf2/ERK通路的激活以及Bcl-2與P53蛋白表達有關。

銀杏葉提取物;糖尿病視網膜病變;Nrf2/ERK通路;Bcl-2;P53

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的并發癥之一，作為一種進行性發展的神經退行性病變，主要表現為視網膜多細胞結構與功能的異常，如視網膜神經節細胞的凋亡。糖尿病視網膜病變的發病機制尚未明確，因此臨床的預防和治療困難。銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)提取于銀杏科銀杏屬銀杏的干燥葉，其主要有效成分銀杏黃酮苷和銀杏內酯被臨床廣泛用于預防和治療心腦血管和神經系統的疾病。Chung等［1］研究發現銀杏葉提取物中的銀杏內酯可通過擴張血管增加脈絡膜和視網膜的血液供應，保護視神經。另有學者發現銀杏葉提取物是一種強抗氧化劑，可促進Muller細胞的谷胱甘肽產生［2］。銀杏葉提取物可以減輕糖尿病視網膜病變中視網膜及玻璃體內的纖維組織增生［3］。Moreau等［4］給大鼠口服帶放射性元素標記的銀杏葉提取物，發現銀杏葉提取物可在視網膜上達到足夠的濃度并發揮其功效，提示銀杏葉提取物能夠對視網膜產生相關的作用。本實驗通過觀察銀杏葉提取物對糖尿病大鼠視網膜病變的作用，并初步研究其作用機制。

材料和方法

1 實驗動物

Goto-Kakizaki(GK)大鼠 40只，SPF級，體重(300±20)g，購自上海斯萊克實驗有限公司;Wistar大鼠10只，SPF級，體重(300±20)g，購自南京均可生物工程有限公司。飼養于室溫(22℃ ±2℃)，相對濕度(60±5)%，日照12 h，晝夜循環，自由飲水、進食。

2 實驗試劑

銀杏葉提取物購自中國藥品生物制品檢定所;伊凡斯蘭購自Sigma;核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、p-ERK和t-ERK抗體購自Santa Cruz，Bcl-2、P53抗體購自碧云天生物技術有限公司。

3 實驗方法

3.1 給藥處理與分組 GK大鼠隨機分為4組，每組10只:模型組(DR組)，GBE-低劑量(low dose，L) 組(GBE-L組)、中劑量(medium dose，M)組(GBE-M 組)和高劑量(high dose，H)組(GBE-H組);Wistar大鼠作為正常對照組(control組)。GBE-低、中和高劑量組大鼠分別每日灌胃銀杏葉提取物100 mg/kg，150 mg/kg和200 mg/kg，每天1次，共35 d。其中DR組與control組大鼠正常飲食。

3.2 血糖監測 給藥完成后，監測前12 h禁食，尾尖斷尾取血，血滴于試紙上，用血糖儀檢測。

3.3 血-視網膜屏障損傷監測 給藥完成后，將30 g/L伊凡斯蘭尾靜脈快速注入。2 h后，以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，摘取眼球，操作輕柔(避免損傷視網膜)，分離視網膜。1份用4%多聚甲醛溶液浸泡，置于4℃保存備用。另1份晾干后稱重，加入300 μL甲酰胺65℃孵育15 h，于4℃、38 000 r/min離心25 min。取上清液于628 nm處用分光光度計測量吸光度(A)值之差，參比波長740 nm，重復測量6次。

3.4 TUNEL染色法檢測細胞凋亡 將各組組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水化，PBS洗滌，含2% 蛋白激酶K的雙蒸水中室溫孵育15 min，雙蒸水洗滌2次，加入TUNEL反應液(TdT+熒光素標記dUTP)，并于37℃濕盒中避光孵育1 h，PBS沖洗2次，加入DAPI，20%甘油緩沖液封片。熒光顯微鏡下以552 nm激發波長、535 nm發射波長觀察綠色熒光凋亡細胞。

3.5 Western blot法檢測相關蛋白 取各組視網膜組織，加入裂解液，超聲波細胞粉碎儀充分裂解，提取上清液進行蛋白定量，調整蛋白量。取適量裂解產物，進行SDS-PAGE分離，完成電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1 h，加入I抗孵育過夜，TBST洗膜3次;加入相應 II抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次;進行熒光顯色。

4 統計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行數據處理，各組實驗結果均以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間或組內差異比較采用Bonferroni校正t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 血糖的變化

與control組相比，DR組大鼠的血糖顯著升高，差異有統計學顯著性(P＜0.05);與DR組相比，給予銀杏提取物后，大鼠血糖隨給藥劑量的增大而逐漸降低，差異有統計學顯著性(P＜0.05)，見表1。

2 視網膜組織中伊凡斯蘭的滲透量變化

與control組相比，DR組大鼠視網膜組織中伊凡斯蘭的滲透量顯著升高(P＜0.05);與DR組相比，給予低劑量銀杏提取物治療的大鼠伊凡斯蘭的滲透量有所下降，但差異無統計學顯著性，中劑量組和高劑量組大鼠視網膜組織中伊凡斯蘭的滲透量顯著下降(P＜0.05)，見表1。

表1 銀杏提取物對大鼠血糖和視網膜組織中伊凡斯蘭滲透量的影響Table 1.The effects of Ginkgo biloba extract(GBE)on the blood glucose and osmolality of rat retina(Mean±SD.n=10)

3 大鼠視網膜神經節細胞凋亡的變化

如圖1所示，DR組中可見大量TUNEL染色呈陽性的細胞，給予低劑量銀杏葉提取物處理后，可觀察到呈陽性的細胞少于DR組，但差異無統計學顯著性;給予中、高劑量銀杏葉提取物處理后，呈陽性的細胞數顯著少于DR組(P＜0.05)，并隨劑量升高而減少。

Figure 1.The effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on the apoptosis of ganglion cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs DR.圖1 銀杏葉提取物對大鼠視網膜神經節細胞凋亡的影響

4 各組大鼠視網膜組織中Nrf2、p-ERK和t-ERK蛋白的表達水平變化

與control組相比，DR組的Nrf2和p-ERK蛋白水平略有增加，但差異不具有統計學顯著性;與DR組相比，給予低劑量銀杏葉提取物處理后，Nrf2和p-ERK的蛋白水平有所增加，但差異不具有統計學顯著性，而給予中、高劑量銀杏葉提取物處理后，Nrf2 和p-ERK的蛋白水平顯著增加(P＜0.05)。各組t-ERK蛋白表達水平變化不明顯，見圖2。

5 各組大鼠視網膜組織中Bcl-2和P53蛋白的表達水平變化

與control組相比，DR組中Bcl-2的蛋白表達水平顯著降低，P53蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05);與DR組相比，GBE-L組大鼠視網膜細胞中的Bcl-2和P53蛋白水平無顯著變化;GBE-M組與GBE-H組中的Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，P53蛋白表達水平顯著下降(P＜0.05)，見圖3。

討論

糖尿病性視網膜病變是一種具有嚴重致盲性的眼底病變，主要表現為視網膜毛細血管基底膜的增厚和血管的通透性增加，從而導致血-視網膜屏障被破壞，其中氧自由基參與了其病變的過程。Nrf2是一種能夠調節多種抗氧化應激蛋白基因和二相解毒酶基因的重要轉錄調節因子，如過氧化氫酶、血紅素加氧酶-1與谷胱甘肽S-轉移酶等，進而可以清除體內的多種氧化性物質和毒性物質［5-6］，保護組織器官免受損傷。此外，研究發現Nrf2能夠被ERK激活而發揮作用［7］。ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族的一個重要的亞族，通過使多種轉錄因子磷酸化來調控細胞功能［8］。研究表明ERK的磷酸化/活化在腦缺血再灌注損傷中具有重要的神經保護作用［9］。有學者研究發現甲酯化脂氧素通過激活ERK磷酸化從而抑制細胞凋亡并促進細胞修復［9-10］。那么，銀杏葉提取物是否通過Nrf2/ERK信號通路對視網膜發揮保護作用?本實驗研究發現，給予不同劑量銀杏葉提取物處理后，視網膜神經節細胞的凋亡減少，此外Nrf2與磷酸化的ERK蛋白水平顯著上升，提示這一過程與Nrf2/ERK信號通路的激活有關。另一方面，糖尿病視網膜病變誘導大鼠視網膜抗凋亡基因bcl-2的下調與P53蛋白上調，銀杏葉提取物能夠逆轉這一變化，其中P53能夠促進多種細胞組織發生凋亡［11］。綜上所述，本實驗研究發現銀杏葉提取物能夠降低糖尿病視網膜病變大鼠的血糖，可能通過激活Nrf2/ERK信號通路，調控Bcl-2與P53蛋白的表達，從而抑制視網膜神經節細胞凋亡，對視網膜具有保護作用。Nrf2/ERK信號通路可能是銀杏葉提取物的作用靶點，本實驗為銀杏葉提取物用于臨床上治療糖尿病視網膜病變提供了實驗依據。

Figure 2.The effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on protein expression of Nrf2，p-ERK and t-ERK.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs DR.圖2 銀杏葉提取物對大鼠視網膜中Nrf2、p-ERK和t-ERK蛋白表達水平的影響

Figure 3.The effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on the protein expression of Bcl-2 and P53.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs DR.圖3 銀杏葉提取物對大鼠視網膜中Bcl-2、P53蛋白表達水平的影響

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(責任編輯:盧 萍，余小慧)

Effect of Ginkgo biloba extract on retinopathy in diabetic rats

DU Qian，TIAN Qiu-xia，FU Li-ping，LI Jian-bo

(Department of Ophthalmology，Nanyang Central Hospital，Nanyang 473000，China.E-mail:nyduyaping@126.com)

AIM:To investigate the effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on diabetic retinopathy(DR)and its possible mechanism in rats.METHODS:Goto-Kakizaki(GK)rats were used as a DR model，and were treated with different doses of GBE.Normal Wistar rats were used as the control.Blood glucose and retina barrier injury were analyzed，respectively.Ganglion cell apoptosis was detected by TUNEL staining.Moreover，the protein expression of nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)，ERK，Bcl-2 and P53，and ERK phosphorylation were examined by Western blot.RESULTS: GBE reduced blood glucose in the DR rats，attenuated retina barrier injury，and decreased the apoptosis of ganglion cells.Furthermore，the expression of Nrf2 and Bcl-2，and phosphorylation of ERK were increased after GBE treatment，whereas P53 expression was decreased.CONCLUSION:GBE protects ganglion cells against apoptosis in DR rats，which may be through activation of Nrf2/ERK pathway and regulating Bcl-2 and P53 expression.

Ginkgo biloba extract;Diabetic retinopathy;Nrf2/ERK pathway;Bcl-2;P53

R774.1;R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.028

1000-4718(2016)07-1323-04

2016-02-02

2016-04-18

△Tel:0377-3200096;E-mail:nyduyaping@126.com