GLP-1下調非酒精性脂肪肝大鼠SOCS-3 和SREBP-1c的表達*

侯洪濤， 裘艷梅， 張 建， 胡義亭， 蘇少慧， 王玉珍

(1河北省人民醫院消化科，河北石家莊050051;2河北醫科大學第二醫院兒科，河北石家莊050000)

GLP-1下調非酒精性脂肪肝大鼠SOCS-3 和SREBP-1c的表達*

侯洪濤1△， 裘艷梅2， 張 建1， 胡義亭1， 蘇少慧1， 王玉珍1

(1河北省人民醫院消化科，河北石家莊050051;2河北醫科大學第二醫院兒科，河北石家莊050000)

目的:探討胰高血糖素樣肽-l(GLP-1)對非酒精性脂肪肝大鼠SOCS-3和SREBP-1c mRNA表達的影響。方法:將雄性SD大鼠32只隨機分為正常對照(NC)組、高脂(HF)組和HF+利拉魯肽(Lira)組。HF組和HF+Lira組給予高脂飼料喂養16周，HF+Lira組高脂喂養12周后，給予Lira 600 μg·kg－1·d－1腹腔注射4周。在16周末處死大鼠。全自動生化儀檢測血清ALT、AST、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC);GPO-PAP法測定肝臟TG含量;酶聯免疫法測定空腹胰島素，并計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR);光學顯微鏡下觀察肝臟病理變化;RT-qPCR法測定肝組織SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表達水平。結果:與NC組相比，HF組血清ALT、AST、TG、TC、肝TG、FINS及HOMA-IR均明顯升高(P＜0.01);HF+Lira組與HF組相比，血清的ALT、AST、TG、TC、肝TG、FINS 及HOMA-IR均下降，差異有統計學顯著性(P＜0.05)。HF組肝組織SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表達水平較NC組顯著增強(P＜0.01);HF+Lira組較HF組SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表達顯著下降(P＜0.05)。結論: Lira可能通過下調肝組織SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表達，改善IR，減少肝臟TG沉積，從而對非酒精性脂肪性肝病起到治療作用。

非酒精性脂肪性肝病;胰高血糖素樣肽-l;固醇調節元件結合蛋白-1c;細胞因子信號轉導抑制物-3

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver di sease，NAFLD)以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征，且無過量飲酒史的臨床綜合征，約70%-90%的患者有單純性脂肪肝，10%～30%的NAFLD患者存在非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，部分患者會發展為 NASH相關肝硬化［1］。近年來，NAFLD呈現以高患病率、低齡化趨勢，嚴重危害了人們的健康。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是NAFLD的始動因素，在NAFLD的發病機制中起重要作用。研究發現，細胞因子信號轉導抑制物-3(suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)在NAFLD發病機制中起重要作用，其可以影響胰島素和細胞因子信號轉導，導致胰島素抵抗［2］。SOCS-3的過表達還可引起固醇調節元件結合蛋白-1c(sterolregulatory elementbinding protein-1c，SREBP-1c)的表達增加。SREBP-1c是參與脂肪合成基因的主要轉錄調節因子［3］，能使肝臟脂質尤其是甘油三酯含量增加，從而導致肝臟脂肪變性。利拉魯肽(liraglutide，Lira)是胰高血糖素樣肽-l(glucagonlike peptide-1，GLP-1)類似物，動物和人體的實驗均發現GLP-1能改善胰島素抵抗及肝脂質沉積，已越來越多地被應用于NAFLD的治療研究當中。本研究通過高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，探討利拉魯肽對NAFLD大鼠SOCS-3和SREBP-1c表達的影響。

材料和方法

1 材料與試劑

雄性SD大鼠32只(6周齡，體質量140～150 g)和普通飼料及豬油(河北醫科大學實驗動物中心);膽固醇(河北醫科大學海森醫藥有限公司);利拉魯肽(Novo Nordisk);胰島素酶聯免疫試劑盒(南京建成生物有限公司);TG試劑(GPO-PAP法，Roche);TRIzol試劑盒、逆轉錄體系和擴增體系(北京賽百盛基因技術有限公司)。引物由北京賽百勝基因技術有限公司合成。

2 動物模型及分組

大鼠適應性喂養1周后，隨機分為2組:正常對照(normal control，NC)組10只，給予普通飼料;高脂(high fat，HF)組22只，給予高脂飼料(普通飼料88%、豬油10%、膽固醇2%)。飼養12周后，隨機處死高脂組2只，進行肝組織切片HE染色確認制備模型成功。高脂組再隨機分為HF組和HF+Lira組，每組10只，HF+Lira組給予高脂喂養的同時腹腔注射藥物利拉魯肽600 μg·kg－1·d－1，每日1 次;HF組高脂飼料喂養的同時給予等體積生理鹽水腹腔注射。在16周末禁食12 h，以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉并處死所有大鼠，采血分離血清。

3 實驗方法

3.1 肝組織病理學觀察 每只大鼠取相同部位肝組織，置于4%多聚甲醛固定液中，常規脫水，石蠟包埋，切片，HE染色后光鏡下觀察肝臟脂肪變程度。

3.2 血和肝臟生物化學指標的測定 全自動生化儀檢測血總甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。酶聯免疫法測定空腹血清胰島素(fasting insulin，FINS)，由公式(FBG ×FINS/22.5)計算胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)。每只大鼠取相同部位肝組織50 mg，應用氯仿/甲醇制備肝組織勻漿并提取脂質，采用GPO-PAP法測定肝臟TG含量。

3.3 肝組織SOCS-3和SREBP-1c的mRNA測定

用TRIzol試劑盒提取肝組織總RNA，在逆轉錄酶的催化下合成cDNA，以cDNA為模板在Taq DNA聚合酶催化下進行PCR擴增。PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀采集圖像，PCR儀獲得產物Ct值，采用2－ΔΔCt相對定量計算公式計算分析。擴增條件為95℃ 3 min;95℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 60 s，循環40次;72℃ 10 min。SOCS-3的上游引物為5’-CAAGAACCTACGCATCCA-3’，下游引物為5’-GGTGGTAAAGAAAAGGAAGG-3’(擴增產物為150 bp);SREBP-1c的上游引物為5’-CTGCTTGGCTCTTCTCTTT-3’，下游引物為 5’-CTTGTTTGCGATGTCTCC-3’(擴增產物為89 bp);β-actin的上游引物為5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物為5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’(擴增產物為150 bp)。

4 統計學處理

改革開放初期，我國興建了大量高度資源依賴、高度資源消耗的大型國有工業企業。在過去幾十年的發展中，這些企業依賴當地的資源能源優勢取得了快速發展，成為了當地經濟發展的支柱，在促進地區經濟增長、經濟結構優化、提供就業和吸納外部資源等方面起著積極作用。

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組之間比較用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 大鼠一般狀態、肝臟形態學改變

3 組大鼠全部存活;NC組大鼠皮毛光澤，靈活好動;HF組大鼠不喜活動，皮毛光澤度差。肉眼觀察，NC組大鼠肝臟色澤紅潤，邊緣銳利整齊，HF組大鼠肝臟體積增大，邊緣圓鈍，色澤變黃，切面有油膩感，HF+Lira組大鼠肝臟體積較HF組減小，呈淺黃色，油膩感減輕。

2 肝組織病理學檢查

光鏡下觀察NC組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索呈放射狀排列，胞質均勻，無脂滴浸潤，匯管區及小葉內無炎細胞浸潤;HF組大鼠肝細胞排列紊亂，細胞內有較多脂滴，部分肝細胞變性，有炎細胞浸潤;HF+Lira組肝細胞脂肪變明顯改善，肝細胞內有少量脂肪滴，炎細胞浸潤改善，見圖1。

Figure 1.Histopathology of liver tissue in each group(HE staining，×100).圖1 各組大鼠肝組織病理學檢查

3 血清AST、ALT、TC及TG的變化

與NC組相比，HF組血清AST、ALT、TC及TG升高，差異具有統計學顯著性(P＜0.01);與HF組相比，HF+Lira組血清AST、ALT及TC下降(P＜0.01)，HF+Lira組血清TG水平明顯降低，差異均有統計學顯著性(P＜0.05);HF+Lira組血清AST、ALT及TC較NC組升高，差異有統計學顯著性(P＜0.05);HF組血清TG水平較NC組明顯升高，差異有統計學顯著性(P＜0.01)，見表1。

表1 大鼠血清生物化學指標的變化Table 1.Serum biochemical indicators in the rats(Mean±SD.n=10)

4 肝臟的TG、FINS及HOMA-IR的變化

與NC組比較，HF組肝臟TG、FINS及HOMA-IR明顯升高，差異有統計學顯著性(P＜0.01);與HF組比較，HF+Lira組肝臟TG水平降低(P＜0.05)，HF+Lira組 FINS及 HOMA-IR水平降低(P＜0.01)，差異均有統計學顯著性，見表2。

5 肝組織SOCS-3及SREBP-1c的mRNA表達水平

表2 大鼠肝臟甘油三酯、空腹血清胰島素及胰島素抵抗指數的變化Table 2.Triglyceride(TG)of liver，fasting insulin(FINS)and insulin resistance index(MOMA-IR) in the rats (Mean±SD.n=10)

NC組大鼠肝組織有少量SOCS-3和SREBP-1c 的mRNA表達;HF組SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表達較NC組顯著增強(P＜0.01);HF+Lira組較HF組SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表達顯著下降(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of SOCS-3(A)and SREBP-1c(B)in the liver tissues of rats detected by RT-qPCR.M:marker.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs NC group;##P＜0.05 vs HF group.圖2 實時熒光定量PCR檢測大鼠肝組織SOCS-3及SREBP-1c mRNA的表達情況

討論

NAFLD是與代謝性疾病相關的肝臟疾病，常和糖尿病、肥胖、高脂血癥并存，為代謝綜合征在肝臟的表現。NAFLD的發生、發展與遺傳、環境、代謝、腸道微生物及生活方式等多種因素相關，NAFLD的危害不僅在于其可引起肝硬化、肝衰竭及肝癌，其還可以導致心腦血管疾病的死亡率和2型糖尿病的發病率增加。NAFLD的發病機制尚未完全闡明，目前最為人們接受和認可的觀點是Day和James提出的“二次打擊”學說［4］。第一次打擊是以胰島素抵抗為中心所引起的肝細胞內脂肪沉積;第二次打擊主要是氧化應激和脂質過氧化，是疾病進展的關鍵。IR是導致肝臟脂質過度沉積的原發病因，是NAFLD發病的中心環節，IR不僅參與首次打擊，也參與第二次打擊［5］。

SOCSs是一類具有抑制Janus激酶-信號轉導及轉錄活化因子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)信號轉導的蛋白質家族，包括8個SOCS家族成員(SOCS1～SOCS7)，它們的結構類似，均由位于中央的SH2區、N區和羧基端的SOCS盒組成。JAK-STAT信號轉導的瀑布級聯效應是許多細胞因子的胞內信號轉導通路。SOCS-3 是SOCS家族的主要成員之一，在體內廣泛分布于肝臟、白色脂肪、胰腺、心臟、腦、小腸、大腸等組織器官。IL-6、IL-2、紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、生長激素等許多細胞因子，都能誘導SOCS-3的表達，上調的SOCS-3通過多個環節、多種途徑影響胰島素信號轉導，導致胰島素抵抗［6］，在NAFLD的IR機制中發揮重要作用。SOCS-3還參與了其它細胞因子誘導的胰島素抵抗。Senn等［7］通過體外培養人肝癌細胞進行研究，發現SOCS-3參與了IL-6介導的肝細胞胰島素抵抗。SOCS-3亦可引起瘦素抵抗［8］，瘦素抵抗在NAFLD形成過程中亦起著重要作用。本實驗應用 liraglutide干預NAFLD大鼠4周后，發現SOCS-3表達水平降低，并且減輕了胰島素抵抗。

研究發現［9］NAFLD時肝臟SOCS-3表達上調不僅引起胰島素抵抗，還能通過上調肝臟SREBP-1c的表達使脂肪酸合成增加以及肝臟脂肪沉積。SREBP-1c是一類位于內質網上的膜連接蛋白，是SREBPs中的一員，主要在肝臟和脂肪細胞中表達，它能調控脂肪細胞的分化和脂肪在細胞內的異位積聚，是動物體內脂質合成的一個重要的調節因子，在NAFLD形成中具有重要的作用。SREBP-1c的調控主要發生在轉錄水平，它直接參與調控有關脂肪酸、甘油三酯合成和葡萄糖代謝相關酶基因的表達，包括乙酰輔酶A合酶、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FAS)等，能激活脂肪酸合成途徑中多種基因轉錄子，啟動合成程序，從而使肝臟脂質尤其是甘油三酯含量增加，從而導致肝臟脂肪變性。SOCS-3是JAK-STAT通路的負向調節因子，STAT能夠抑制SREBP-1c的啟動子活性，SOCS-3又可以下調STAT，當其介導的阻抑作用減弱時SREBP-1c表達增強。本研究結果顯示，高脂飲食喂養大鼠12周后SREBP-1c的mRNA表達水平增加，肝臟TG含量增多，liraglutid能夠降低SREBP-1c的mRNA表達，降低肝臟TG含量，并且肝組織SOCS-3的mRNA表達水平與SREBP-1c 的mRNA呈正相關。

GLP-1是由腸道L細胞分泌的一種生理性多肽，是腸促胰島素的一種，因其具有促進胰島素釋放、延緩胃排空、降低胰升血糖素及降低食欲等生理作用，目前被廣泛應用于2型糖尿病的治療。Liraglutide是新近合成的一種GLP-1受體激動劑，與人GLP-1具有97%同源性。GLP-1和細胞上的GLP-1受體結合實現其生物學作用，研究表明，肝細胞上亦有GLP-1受體的表達［10］。Trevaskis等［11］通過建立NASH動物模型發現，GLP-1受體激動劑能夠改善肝臟脂質沉積，并且能改善NASH小鼠的代謝、生化及組織病理學參數。本實驗結果也顯示，經給藥治療4周后，HF+Lira組大鼠血清ALT、AST、TG及TC水平明顯降低，肝臟TG含量和空腹胰島素水平降低，肝臟脂肪變及炎癥減輕。本實驗也提示，liraglutide可能通過下調肝組織SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表達，改善IR及肝臟脂質代謝，而對NAFLD起治療作用。

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(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

GLP-1 down-regulates mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c in rats with nonalcoholic fatty liver disease

HOU Hong-tao1，QIU Yan-mei2，ZHANG Jian1，HU Yi-ting1，SU Shao-hui1，WANG Yuzhen1

(1Department of Gastroenterology，People’s Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050051，China;2Department of Pediatrics，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China.E-mail:llvzi@126.com)

AIM:To investigate the effects of glucagon-like peptide-1(GLP-1)on mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c in the rats with nonalcoholic fatty liver disease.METHODS:Male SD rats were randomly divided into normal control(NC)group，high fat(HF)group and HF+liraglutide(Lira)group.The rats in HF group and HF+ Lira group were given high-fat diet for 16 weeks.After 12 weeks of high-fat diet feeding in HF+Lira group，Lira(600 μg ·kg－1·d－1)was intraperitoneally injected for 4 weeks.At the end of the 16th week，the rats were killed.The pathological changes of the liver were observed under optical microscope.The serum levels of alanine aminotransferase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)，triglyceride(TG)and total cholesterol(TC)were detected by automatic biochemical analyzer.TG contents of liver were measured by GPO-PAP method.The fasting insulin(FINS)was determined by ELISA，and insulin resistance index was assessed by homeostasis mode assessment(HOMA-IR).The mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c in the liver tissues was detected by RT-qPCR.RESULTS:Compared with NC group，HOMA-IR，TG of liver，and the serum levels of ALT，AST，TG，TC and FINS in HF group were obviously increased(P＜0.01).Compared with HF group，HOMA-IR，TG of liver，and the serum levels of ALT，AST，TG，TC and FINS in HF+Lira group were all obviously decreased(P＜0.05 or P＜0.01).The mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c in HF group was significantly higher than that in NC group(P＜0.01).The mRNA expression of SOCSV3 and SREBP-1c in HF+Lira group was significantly decreased as compared with HF group(P＜0.05).CONCLUSION:Liraglutide may improve the IR and re-duce TG of liver through decreasing the mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c，so as to play a therapeutic role in nonalcoholic fatty liver disease.

Nonalcoholic fatty liver disease;Glucagon-like peptide-1;Sterol regulatory element binding protein-1c;Suppressor of cytokine signaling-3

R575.5;R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.026

1000-4718(2016)07-1312-05

2015-12-21

2016-03-09

河北省衛生計生委基金資助項目(No.ZL20150117)

△Tel:0311-85989910;E-mail:llvzi@126.com