生長抑素聯合大柴胡湯對重癥急性胰腺炎大鼠的作用

馮 輝， 吳 標， 趙習德， 郭寶瑞

(新鄉醫學院第一附屬醫院中西醫結合科，河南新鄉453100)

生長抑素聯合大柴胡湯對重癥急性胰腺炎大鼠的作用

馮 輝△， 吳 標， 趙習德， 郭寶瑞

(新鄉醫學院第一附屬醫院中西醫結合科，河南新鄉453100)

目的:建立重癥急性胰腺炎大鼠模型，研究生長抑素(奧曲肽)聯合大柴胡湯對急性重癥胰腺炎的作用及初步機制。方法:50只大鼠隨機分為假手術組、模型組、奧曲肽組、大柴胡湯組與聯合組，經相應處理后記錄腹水量，測定血清中淀粉酶(amylase，AMY)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和肌酐(creatinine，Cr)的水平，HE染色后觀察胰腺組織形態，Western blot檢測胰腺細胞核中NF-κB與細胞中IκBα的蛋白表達水平，qPCR檢測胰腺細胞中ICAM-1與IL-1的mRNA表達水平。結果:生長抑素聯合大柴胡湯能有效降低重癥急性胰腺炎大鼠的腹水量以及血清中AMY、ALT和Cr的水平;重癥急性胰腺炎可導致胰腺細胞核NF-κB蛋白表達升高，IκBα蛋白表達降低，ICAM-1和IL-1 mRNA表達升高。生長抑素聯合大柴胡湯可逆轉這些改變。結論:生長抑素聯合大柴胡湯可以減輕大鼠的急性重癥胰腺炎，其機制可能與抑制NF-κB信號通路以及ICAM-1和IL-1表達有關。

急性重癥胰腺炎;奧曲肽;大柴胡湯;NF-κB;ICAM-1;IL-1

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是外科常見的急腹癥之一，依據胰腺壞死的情況、并發癥的嚴重程度以及臟器的損壞情況分為輕型、重癥輕型與重癥3種類型，后2種統稱為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)，約占急性胰腺炎患者的30%。由于重癥急性胰腺炎的發病機制尚未明確，因此缺乏有效的藥物與治療手段。由于并發癥多，病死率高，可引發多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)［1－3］。生長抑素是一種廣泛分布與腦、胃腸道、內外分泌腺等部位的多肽，具有抑制胰腺胰液和胰酶分泌，對胰腺細胞具有保護作用。奧曲肽(octreotide，Oct)是人工合成的長效生長抑素八肽藥物，已有研究表明生長抑素能夠抑制重癥胰腺炎大鼠胰酶的釋放［4］。此外有學者發現，大柴胡湯(Dachaihu decoction，DCHD)能夠預防重癥胰腺炎合并腹腔間隔室綜合征，療效顯著［5］。大柴胡湯由柴胡、黃岑、半夏、芍藥、枳實、大黃、生姜和大棗8味中藥組成。研究顯示，大柴胡湯能夠有效改善急性水腫性胰腺炎，并能降低血清淀粉酶(amylase，AMY)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶的水平，有助于血液流向肝臟和胰腺，具有顯著的抗炎作用［6］。目前臨床還沒有采用生長抑素聯合大柴胡湯治療急性重癥胰腺炎的研究，因此，我們探討生長抑素聯合大柴胡湯對急性重癥胰腺炎大鼠的作用及其相關的初步機制。

材料和方法

1 實驗動物

實驗選用SPF級Wistar大鼠50只，雄性，體重(230±20)g，由湖北省疾病預防控制中心動物實驗中心提供，正常飲食飼養，室溫(22±2)℃，濕度(60 ±5)%，每天照明12 h。

2 實驗藥物與試劑

大柴胡湯主方為柴胡15 g，黃岑9 g，半夏9 g，芍藥9 g，枳實9 g，大黃6 g，生姜15 g，大棗5個，由廣州中醫藥大學附屬第一醫院中藥房煎制。大鼠的給藥劑量計算公式為dB=dA×RB/RA×(WA×WB) 1/3，dA和dB分別為人與大鼠的體重系數(mg/kg)，RA和RB分別為人和大鼠的體型系數(RA=10，RB =59)，WA和WB分別為人和大鼠的體重(kg)，大鼠的給藥量相當于含生藥8.2 g·kg－1·d－1［7］;?；悄懰徕c購自Sigma;奧曲肽購自Sandoz;NF-κB和IκBα抗體購自北京博奧森有限公司。

3 方法

3.1 重癥急性胰腺炎大鼠模型的制備 造模前禁食12 h，飲水不限制。稱重后，采用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后固定在手術臺上，腹部剪毛消毒，于劍突下切開，顯露十二指腸與胰膽管，采用無損傷血管夾雙重夾閉胰膽管遠端膽管近肝門處，用0.45 mm頭皮針經十二指腸外壁穿入腸腔，經十二指腸乳頭滑行穿入胰膽管末端，用無損傷血管夾固定針頭。用微量泵恒速(0.1 mL/mim)向主胰管內推注新鮮配置的5%牛黃膽酸鈉溶液(1 mL/kg)，注射完成后，抽出頭皮針，但仍保留無損傷血管夾繼續夾閉5 min，使牛磺膽酸鈉溶液充分進入各胰腺小葉，5 min后取下血管夾，復位十二指腸，關腹縫合。假手術組的操作與上述基本相同，但把注入胰膽管內液體改為生理鹽水。

3.2 大鼠分組與給藥處理 將SPF級雄性大鼠隨機分為5組(n=10):假手術(sham)組、SAP組、Oct組、DCHD組和聯合治療(combined treatment，COM)組。Oct組大鼠造模成功后，給予股靜脈注入奧曲肽10 μg/kg;DCHT組大鼠造模成功后0 h、2 h、4 h時分別灌胃大柴胡湯;COM組同時采用上述2組的處理方法;SAP組給予等量的生理鹽水1 mL/kg。

3.3 腹水量的測定 將干棉球稱重，用干棉球吸附各組大鼠腹水后稱重，并計算腹水量，計算公式:腹水量=濕棉球重量－干棉球重量。

3.4 血清指標的測定 造模后12 h，用注射器進行心臟穿刺抽血約3 mL，4 000 r/min離心20 min，取上層血清，采用全自動生化檢測儀測量各組大鼠血清AMY、ALT和肌酐(creatinine，Cr)的水平。

3.5 HE染色 造模12 h后，剪去各組大鼠胰腺組織，用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片。二甲苯脫蠟，依次用無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和70%乙醇浸泡5 min，蘇木素染色15 min，蒸餾水沖洗，伊紅染色3 min，依次泡入70%、85%、95%的乙醇至無水乙醇各1 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。

3.6 免疫印跡法 取各組大鼠胰腺組織，其中一部分組織使用胞漿胞核蛋白提取試劑盒提取細胞核中蛋白，另一部分組織離心，提取細胞總蛋白。定量并調整蛋白量。取等量裂解產物，進行 12%SDSPAGE。電轉至硝酸纖維素膜上，加入脫脂牛奶，室溫封閉2 h，加入I抗孵育過夜，TBST洗滌2次;再加入相對應II抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，化學發光法顯色凝膠成像系統掃描灰度值進行分析。

3.7 qPCR 取各組大鼠胰腺組織，按照TRIzol說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用PCR儀進行擴增，所用引物序列:ICAM-1的上游引物序列為5’-GCCTGGGGTTGGAGACTAAC-3’，下游引物序列為5’-CTGTCTTCCCCAATGTCGCT-3’;IL-1的上游引物序列為5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3’，下游引物序列為5’-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3’。擴增條件為93℃ 35 s，65℃ 40 s，72℃ 50 s，共34個循環;74℃3 min。所得結果直接在熒光定量操作系統中進行比較分析，目標基因的相對定量用2－ΔΔCt公式計算。

4 統計學處理

數據采用SPSS 15.0統計軟件進行分析，所有實驗結果采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間差異應用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗;以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 各組大鼠腹水量測定

Sham組大鼠只有少量無色透明的腹水;SAP組大鼠有大量紅褐色的腹水，顯著多于sham組(P＜0.05);與sham組相比，Oct組和DCHD組大鼠的腹水量明顯減少(P＜0.05)，呈紅褐色，而COM組大鼠腹水量更顯著減少(P＜0.05)，見圖1。

2 各組大鼠血清指標結果

與sham組相比，SAP組大鼠血清中AMY、ALT 和Cr的水平均顯著升高(P＜0.05);與SAP組相比，Oct組大鼠血清中的AMY、ALT和Cr的水平明顯降低(P＜0.05)，DCHD組大鼠血清中AMY與ALT的含量水平明顯降低(P＜0.05)，Cr的含量水平無顯著變化，COM組大鼠血清中的AMY、ALT和Cr的水平顯著降低(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.Quantity of ascites of rat in each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs SAP group.圖1 各組大鼠腹水量的比較

3 各組大鼠胰腺組織的HE染色

Figure 2.The levels of AMY，ALT and Cr in serum of rats in each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs SAP group.圖2 各組大鼠血清中AMY、ALT、Cr的含量水平變化

Sham組大鼠的胰腺組織無充血，無炎性細胞浸潤以及無水腫;SAP組大鼠的胰腺組織肉眼可見明顯出血，腺泡細胞腫大并大量壞死，葉間隔變寬，結構間不清晰，大量炎性細胞浸潤;Oct組和DCHD組大鼠的胰腺組織肉眼可見出血情況無SAP組嚴重，可見有腺泡細胞壞死，葉間隔變寬，有炎細胞浸潤;COM組大鼠的胰腺組織有少量出血，腺泡壞死與葉間隔變寬情況有所減輕，見圖3。

Figure 3.HE staining of pancreatic tissues of rat in each group(×200).圖3 各組大鼠胰腺組織的HE染色

4 Western blot法檢測NF-κB與IκBα的蛋白表達水平

Western blot檢測結果顯示，sham組胰腺細胞核中的NF-κB蛋白幾乎不表達，SAP組胰腺細胞核中NF-κB蛋白呈高表達，與SAP組相比，Oct組、DCHD組與COM組胰腺細胞核中的NF-κB蛋白表達顯著下降(P＜0.05)，其中以COM組下降幅度最大;與sham組相比，SAP組細胞中IκBα的蛋白表達顯著下降(P＜0.05)，與SAP組相比，Oct組、DCHT組與COM組胰腺細胞中 IκBα的蛋白表達有所上升(P＜0.05)，其中COM組的上升幅度最大，見圖4。

Figure 4.The protein expression of NF-κB and IκBα in rat pancreatic tissues in each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs SAP group.圖4 各組大鼠胰腺組織中NF-κB與IκBα的蛋白表達水平

5 qPCR檢測胰腺組織中 ICAM-1與 IL-1的mRNA表達水平

與sham組相比，SAP組大鼠胰腺組織中ICAM-1 與IL-1 mRNA表達顯著升高(P＜0.05);與SAP組相比，Oct組、DCHD組與COM組大鼠的胰腺組織中ICAM-1與IL-1的mRNA表達明顯升高(P＜0.05)，其中以COM組升高幅度最大，見圖5。

Figure 5.The mRNA expression of ICAM-1 and IL-1 in rat pancreatic tissues in each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs SAP group.圖5 各組大鼠胰腺組織中ICAM-1與IL-1的mRNA表達水平

討論

重癥急性胰腺炎是消化系統的危重癥，病死率極高，患者痛苦，嚴重危害人類健康，屬于臨床難治性疾病之一。發病時，胰腺腺泡細胞內的消化酶被激活而產生自身消化，進一步活化中性顆粒，釋放蛋白水解酶，導致其它器官損傷。給予生長抑素聯合大柴胡湯后，重癥急性胰腺炎大鼠的腹水量以及血清中AMY、ALT和Cr的水平均有明顯降低，此外，通過HE染色觀察到大鼠胰腺組織的炎癥情況也得到明顯改善，提示生長抑素聯合大柴胡湯可能具有減輕癥急性胰腺炎的作用。

NF-κB是一種具有多向逆轉錄作用的蛋白質，是促炎癥基因表達的樞紐之一。NF-κB的活化與炎癥因子的過度表達，導致細胞因子間的失衡產生級聯反應。其中IκBα是NF-κB的主要抑制性調控蛋白，當IκBα磷酸化后，會誘發IκBα被蛋白酶體降解，使得NF-κB迅速轉位至細胞核，啟動靶基因轉錄，稱為NF-κB的經典激活途徑。研究表明，炎癥組織中的NF-κB出現活化，中性粒細胞浸潤，釋放細胞因子，產生氧自由基，導致炎癥的加速發展［8－10］。因此，抑制NF-κB的活化可以抑制多種細胞因子的表達并減輕微血管通透性，研究表明在重癥急性胰腺炎的動物模型中，抑制NF-κB后淀粉酶、脂肪酶等反映胰腺炎的各項指標均有良好的改善效果，且對臟器也具有一定的保護作用［11］。我們實驗發現，重癥急性胰腺炎大鼠給予生長抑素聯合大柴胡湯后，與單獨給予生長抑素或大柴胡湯組相比，更能抑制細胞核中NF-κB的表達，細胞中IκBα表達升高，提示生長抑素聯合大柴胡湯的療效可能是通過抑制NF-κB的經典激活途徑而產生作用。此外，ICAM-1是一種單鏈跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，在內皮細胞、淋巴細胞、上皮細胞等少量表達，受到IL-1、TNF-α等因素刺激后，可激活多條細胞內信號轉導途徑，造成細胞增生、分化、凋亡與形態變化，以及生成細胞因子等。我們研究發現，與單獨給予生長抑素或大柴胡湯的大鼠相比，生長抑素聯合大柴胡湯可以抑制細胞中ICAM-1與IL-1。

綜上所述，生長抑素聯合大柴胡湯具有減輕大鼠重癥急性胰腺炎的作用，可能與抑制NF-κB的經典激活途徑以及ICAM-1與IL-1的表達有關。

［1］ Reber HA.Food，fat，and the inflamed pancreas［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2007，5(8):915-916.

［2］ Navicharern P，Wesarachawit W，Sriussadaporn S，et al.Management and outcome of severe acute pancreatitis［J］.J Med Assoc Thai，2006，89(Suppl 3):S25-S32.

［3］ Pezzilli R，Uomo G，Gabbrielli A，et al.A prospective multicenter survey on the treatment of acute pancreatit is in Italy［J］.Dig Liver Dis，2007，39(9):838-846.

［4］ 馬 健.生長抑素對大鼠急性重癥胰腺炎治療作用的實驗研究［D］.青島:青島大學，2007.

［5］ 余 青，曾 萍.大柴胡湯預防重癥胰腺炎合并腹腔間隔室綜合征的療效觀察［J］.中醫臨床研究，2014，6 (26):56-57.

［6］ 程 晶.大柴胡湯對肝郁氣滯型急性胰腺炎患者血清IL-1β和 IL-6的影響［D］.廣州:廣州中醫藥大學，2014.

［7］ 奉典旭，陳亞峰，陳 騰，等.大柴胡湯對急性壞死性胰腺炎大鼠模型的影響［J］.中國中西醫結合外科雜志，2009，15(3):298-302.

［8］ Rakonczay Z Jr，Hegyi P，Takacs T，et al.The role of NF-κB activation in the pathogenesis of acute pancreatitis ［J］.Gut，2008，57(2):259-267.

［9］ 孫 娟，林志輝.高脂血癥對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB活化及腺泡細胞凋亡的影響［J］.中華胰腺病雜志，2011，11(3):207-210.

［10］曾曉晨，王湘英.甘油三酯對大鼠重癥胰腺炎內皮素和一氧化氮表達及病理評分的影響［J］.中國醫師雜志，2011，13(7):900-902.

［11］秦 勇，馬清涌，黨曉燕，等.白藜蘆醇對早期重癥急性胰腺炎大鼠多器官組織氧自由基的影響［J］.西安交通大學學報:醫學版，2007，28(5):572-574.

(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

Combined effect of octreotide and Dachaihu decoction on treatment of severe acute pancreatitis

FENG Hui，WU Biao，ZHAO Xi-de，GUO Bao-rui

(Department of Integrated Chinese and Western Medicine，First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453100，China.E-mail:xyfenghui@126.com)

AIM:To investigate the combined effect of octreotide and Dachaihu decoction on the treatment of severe acute pancreatitis(SAP).METHODS:Wistar rats(n=50)were randomly divided into sham group，SAP group，octreotide group，Dachaihu decoction group and combination group.The quantity of ascites was measured.The levels of amylase，alanine aminotransferase and creatinine in the serum were examined.The morphological changes of the pancreatic tissues were observed by HE staining.The activation of NF-κB and IκBα expression were determined by Western blot.The mRNA expression with ICAM-1 and IL-1 was detected by qPCR.RESULTS:Combined treatment with octreotide and Dachaihu decoction effectively reduced the quantity of ascites and the levels of amylase，alanine aminotransferase and creatinine in the serum in SAP rats.Moreover，combined treatment significantly inhibited SAP-induced activation of NF-κB and decrease in IκBα protein expression，accompanied by a decrease in ICAM-1 and IL-1 mRNA expression.CONCLUSION:Combination of octreotide with Dachaihu decoction effectively attenuates SAP by inhibiting NF-κB signaling pathway and ICAM-1 and IL-1 expression.

Severe acute pancreatitis;Octreotide;Dachaihu decoction;NF-κB;ICAM-1;IL-1

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.023

1000-4718(2016)07-1297-05

2015-12-02

2016-03-01

△Tel:0373-4402024;E-mail:xyfenghui@126.com