青蒿素減輕LPS誘導的腸上皮細胞屏障功能損傷的實驗研究

孫俊波， 趙 璐， 史素琴， 寇振媛， 劉愛娟， 付婷婷

(1河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南省中醫院，河南鄭州450002;2河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南鄭州450008;3河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南鄭州450000)

青蒿素減輕LPS誘導的腸上皮細胞屏障功能損傷的實驗研究

孫俊波1， 趙 璐2△， 史素琴3， 寇振媛1， 劉愛娟2， 付婷婷2

(1河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南省中醫院，河南鄭州450002;2河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南鄭州450008;3河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南鄭州450000)

目的:探究青蒿素對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的大鼠腸上皮IEC-6細胞屏障功能損傷的影響。方法:體外培養IEC-6細胞，隨機分為5組:對照組、LPS(100 mg/L)組和LPS+青蒿素(30、50和100 μmol/L)組，MTT法檢測各組細胞毒性變化，ELISA檢測各組細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的變化，電阻儀檢測腸上皮細胞跨上皮電阻(TER)，酶標儀檢測單層細胞對辣根過氧化物酶(HRP)的通透性，RT-qPCR和Western blot檢測各組細胞緊密連接蛋白(ZO-1、claudin-1和occludin)以及TLR4/MyD88/NF-κB mRNA和蛋白表達的變化。結果:LPS與青蒿素在本實驗濃度范圍對IEC-6細胞均無毒性。與對照組相比，LPS處理下，細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/MyD88/NF-κB的mRNA和蛋白表達明顯增加，ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表達降低。而青蒿素干預下，細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/MyD88/NF-κB mRNA和蛋白表達明顯降低，ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表達升高(P＜0.05)，均呈現濃度依賴性。結論:青蒿素可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕LPS誘導的腸上皮細胞屏障功能損傷。

青蒿素;脂多糖;腸上皮細胞

腸道屏障是機體最重要的免疫防御屏障，它能夠阻止腸道感染并預防炎癥的發生。腸黏膜上皮屏障功能受到損害時，腸腔內細菌等致病性抗原通過受損的腸上皮細胞侵入腸道［1-2］，從而引發全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)以及多器官功能障礙［3］。腸上皮屏障具有的選擇性通透性，是上皮對腸腔內物質通過跨細胞或旁細胞途徑跨過的能力，其中緊密連接(tight junction，TJ)蛋白的結構和功能，與旁細胞的通透性密切相關，而腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等細胞因子可誘導上皮屏障功能損傷［4］。青蒿素(artemisinin，Art)是從菊科植物黃花蒿(Artemisia annua)葉中提取分離出的主要藥用成分，有研究表明，青蒿素除了具有抗瘧作用外，還有免疫調節、抗炎等作用［5］。因此，本文應用細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導IEC-6細胞建立體外腸上皮細胞功能損傷模型，觀察青蒿素對腸上皮細胞屏障通透性、細胞炎性因子的水平以及緊密連接蛋白表達的影響，并探討青蒿素對腸上皮細胞功能保護作用的機制。

材料和方法

1 材料

青蒿素(河南中醫藥大學提供);大鼠小腸上皮IEC-6細胞(ATCC CRL-1592TM)，DMEM培養基，雙抗(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，胎牛血清(Gemini);MTT，二甲基亞砜(DMSO)，鼠抗ZO-1、claudin-1、occludin、MyD88和NF-κB p65多克隆抗體，β-actin鼠抗單克隆抗體(Abcam);羊抗鼠II抗，測定TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒，BCA試劑盒(北京中杉生物有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養與單層上皮模型的建立 IEC-6細胞用pH 7.4的DMEM培養液(含雙抗、10%胎牛血清)培養，當細胞生長至約80%融合時，用0.25%胰蛋白酶、0.53 mmol/L EDTA液消化細胞，按1∶3的比例傳代。參照文獻［6］方法建立單層上皮模型，將IEC-6細胞以5×104/L接種于24孔板Transwell聚碳酸酯膜上常規培養，每2 d更換培養基，并用Millicell ERS電阻測定儀測定跨上皮細胞電阻(transepithelial electrical resistance，TER)以監測細胞單層形成情況，待TER穩定后，說明體外腸上皮單層細胞模型建立成功。

2.2 MTT法檢測細胞活性 將IEC-6細胞以1× 104/L接種于96孔板，分為對照組、LPS(100 mg/L)組、青蒿素(100 μmol/L)組和LPS+不同濃度(30、50和100 μmol/L)青蒿素組，按分組處理細胞。培養24 h，每孔加入20 μL MTT溶液孵育4 h，棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩后用酶標儀檢測490 nm處吸光度值(A490)。

2.3 ELISA檢測細胞炎性因子水平 將IEC-6細胞以5×105/L接種于12孔板，分為對照組、LPS(100 mg/L)組和LPS+不同濃度(30、50和100 μmol/L)青蒿素組，按分組處理細胞。培養24 h，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測各組TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

2.4 腸上皮細胞TER的測定 將IEC-6細胞以5× 105/L接種于Transwell小室，Millicell ERS電阻測定儀測定TER值，待數值穩定后，按上述分組方法處理細胞。培養24 h，分別檢測處理前后的TER值，測得TER值減去空白對照后記錄為每組電阻值。每組做3復孔，實驗重復3次。

2.5 單層細胞通透性的測定 測量大分子物質辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)通過單層細胞的速率，以觀察細胞通透性的改變。IEC-6細胞以5×105/L接種于Transwell小室，將HRP(終濃度3.4×10－6mol/L)加入Transwell小室的上室培養液中，按上述分組處理細胞培養24 h，于上室和下室各取2 μL培養基，置于96孔板內，加入TMB顯色液，酶標儀370 nm處檢測吸光度值，根據標準曲線計算HRP濃度。

2.6 Western blot檢測蛋白的表達 將IEC-6細胞按上述分組處理，培養24 h后，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，煮沸5 min變性后，進行SDSPAGE電泳，上樣量為80 μg。然后以150 mA 3 h轉PVDF膜。3%脫脂奶粉封閉抗原1 h后，加入ZO-1 (1∶500)、claudin-1(1∶500)、occludin(1∶500)、TLR4 (1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000) 和β-actin(1∶1 000)等I抗孵育，4℃過夜，用TBST洗膜，每次5 min，共3次。加入II抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，每次5 min，共3次，加入ECL顯色液曝光顯影。

2.7 RT-qPCR檢測mRNA表達 將IEC-6細胞按上述分組處理，培養24 h后，TRIzol法提取細胞總RNA，并檢測其純度以及完整性。反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR擴增，依據2－ΔΔCt法計算各組mRNA的相對表達量。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 統計學處理

統計學處理計量資料結果用均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，多組間比較用單因素方差分析，各組均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 青蒿素與LPS對IEC-6細胞均無毒性作用

MTT結果顯示，與對照組相比，LPS和青蒿素單獨處理的IEC-6細胞活性無明顯變化，青蒿素對LPS誘導的細胞活性無顯著影響(圖1)。這表明LPS與青蒿素處理(在本實驗濃度范圍)對IEC-6細胞活性均無明顯抑制作用。

Figure 1.The viability of IEC-6 cells after treatment with LPS and artemisinin(Art).Mean±SD.n=3.圖1 LPS和不同濃度青蒿素作用對細胞活力的影響

2 青蒿素降低LPS誘導的IEC-6細胞炎性因子水平

ELISA結果顯示，LPS誘導IEC-6細胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高，而青蒿素降低了LPS誘導的IEC-6細胞TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，并呈現一定的劑量依賴效應，見圖2。

Figure 2.The releases of inflammatory cytokines in the culture supernatant of IEC-6 cells after treatment with LPS and artemisinin(Art).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖2 LPS和不同濃度青蒿素對炎性因子水平的影響

3 青蒿素降低LPS誘導的IEC-6細胞屏障通透性升高

與對照組相比，LPS誘導IEC-6細胞TER值明顯降低，而青蒿素顯著提高LPS誘導的IEC-6細胞TER值。另外，與對照組相比，LPS提高單層細胞對HRP的通透性，而青蒿素顯著降低LPS誘導的IEC-6細胞對HRP的通透性升高，并呈現劑量依賴效應，見圖3。

4 青蒿素降低LPS誘導的細胞緊密連接蛋白的水平

Western blot和 RT-qPCR結果表明，LPS降低IEC-6細胞ZO-1、claudin-1和occludin的表達水平，而青蒿素顯著上調LPS誘導的IEC-6細胞ZO-1、claudin-1和occludin的表達降低，并呈現劑量依賴效應，見圖4。

5 青蒿素下調LPS誘導的TLR4/MyD88/NF-κB表達

Western blot和 RT-PCR結果證明，LPS上調IEC-6細胞TLR4、MyD88和NF-κB p65的表達，而青蒿素顯著降低LPS誘導的IEC-6細胞MyD88和NF-κB p65的表達升高，并呈現劑量依賴效應，見圖5。

Figure 3.The effects of LPS and artemisinin(Art)on the permeability of IEC-6 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖3 LPS和不同濃度青蒿素對細胞通透性的影響

討論

腸黏膜屏障主要由腸黏膜基底膜、上皮細胞層及其表面的黏液層所構成，腸上皮細胞是腸黏膜屏障的主要組織結構基礎［7］。目前已有研究表明在炎性結腸炎、重癥胰腺炎、暴發性肝衰竭等疾病引起的腸黏膜屏障損傷中，均存在腸上皮細胞細胞功能的破壞［8-9］。LPS是革蘭氏陰性菌的致病因子，它直接接觸腸黏膜上皮細胞時，可通過阻斷緊密連接蛋白的磷酸化和去磷酸化過程，導致腸黏膜上皮的通透性增加和腸黏膜功能損傷［10］。本文采用青蒿素干預LPS誘導的IEC-6細胞功能損傷，討論青蒿素對腸上皮細胞通透性等功能的保護作用。實驗結果證明，LPS與青蒿素(在本實驗濃度范圍)對IEC-6細胞均無毒性，可進行進一步研究。

Figure 4.The expression of ZO-1，claudin-1 and occludin after treatment with LPS and artemisinin(Art).A:protein expression;B: mRNA expression.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖4 LPS和不同濃度青蒿素對ZO-1、claudin-1和occludin表達的影響

青蒿素是從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧化基團結構的倍半萜內酯化合物，主要衍生物包括雙氫青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。近年來，越來越多的研究表明，青蒿素及其衍生物具有調節免疫、抗腫瘤以及抗炎的活性［5］。蒿甲醚和青蒿琥酯均能抑制LPS誘導的小膠質細胞炎性因子的水平［11-12］。本研究結果顯示，青蒿素能顯著下調LPS誘導IEC-6細胞中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

Figure 5.The expression of TLR4，MyD88 and NF-κB p65 after treatment with LPS and artemisinin(Art).A:protein expression; B:mRNA expression.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖5 LPS和不同濃度青蒿素對TLR4、MyD88和NF-κB p65表達的影響

單層細胞的TER值是反映腸黏膜屏障通透性的主要指標之一，與細胞單層通透性呈負相關。TER值的減小提示緊密連接結構受到破壞，HRP通過受損的細胞間空隙漏入下室增多，腸道通透性增加［13］。本研究中，細胞TER值的減小與細胞對HRP通透性的增加都表明LPS破壞了腸上皮細胞通透性，而青蒿素顯著增加受損細胞的TER值并降低細胞對HRP通透性。緊密連接區域的特異性蛋白包括跨膜蛋白occludin、膜蛋白ZO-1以及claudin蛋白家族等，其中occludin蛋白是一種跨膜蛋白，位于細胞間緊密連接的縫隙處，在調控細胞間的通透性和信號傳導方面有重要意義。這些緊密連接蛋白表達下調時，緊密連接結構會發生改變，造成細胞多種功能受損［14］。有研究證明，茶黃素、大黃素等中藥成分能夠上調Caco-2細胞中occludin、claudin-1和ZO-1蛋白的水平，減輕Caco-2細胞通透性等功能損傷［14-15］。本研究結果同樣證明，LPS誘導腸上皮細胞中occludin、claudin-1和ZO-1表達降低，而青蒿素上調這些蛋白的表達，并呈現劑量依賴效應。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是模式識別受體的一種，在機體免疫與炎癥反應中發揮關鍵作用。LPS通過TLR4通路誘導幼年動物的腸道屏障功能損傷［16］，MyD88和NF-κB作為TLR4信號通路的下游因子，在炎癥損傷中均有重要作用。有研究證明，青蒿琥酯顯著降低LPS誘導的小膠質細胞BV-2炎性因子水平，其中TLR4/MyD88/NF-κB通路發揮重要的作用［12］。本研究表明，青蒿素顯著下調LPS誘導的細胞TLR4/MyD88/NF-κB的激活，由此，青蒿素可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活，從而發揮對腸上皮細胞損傷的保護作用。

綜上所述，本文利用青蒿素干預LPS誘導的IEC-6細胞屏障功能損傷，發現青蒿素可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路降低腸上皮細胞通透性，并上調細胞緊密連接蛋白的表達。這一發現為青蒿素治療細胞屏障功能損傷相關疾病提供了新的理論基礎，但其具體分子機制有待進一步研究。

［1］ Tulic MK，Vivinus-Nébot M，Rekima A，et al.Presence of commensal house dust mite allergen in human gastrointestinal tract:a potential contributor to intestinal barrier dysfunction［J］.Gut，2016，65(5):757-766.

［2］ 任 翔，傅廷亮，馬明明，等.黃芩苷對腸上皮細胞缺氧復氧損傷后屏障功能的影響［J］.中華實用兒科臨床雜志，2015，30(7):494-497.

［3］ Lee SH.Intestinal permeability regulation by tight junction:implication on inflammatory bowel diseases［J］.Intest Res，2015，13(1):11-18.

［4］ Wang F，Graham WV，Wang Y，et al.Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression［J］.Am J Pathol，2005，166(2):409-419.

［5］ Shi C，Li H，Yang Y，et al.Anti-inflammatory and immunoregulatory functions of artemisinin and its derivatives ［J］.Mediators Inflamm，2015，2015:435713.

［6］ Liu H，Li M，Wang P，et al.Blockade of hypoxia-inducible factor-1α by YC-1 attenuates interferon-γ and tumor necrosis factor-α-induced intestinal epithelial barrier dysfunction［J］.Cytokine，2011，56(3):581-588.

［7］ 陳振勇，代紅梅，涂志剛，等.阻塞性黃疸術后胰島素抵抗與腸黏膜屏障破壞間的相關性［J］.中國病理生理雜志，2013，29(1):165-168，173.

［8］ Fishman JE，Sheth SU，Levy G，et al.Intraluminal nonbacterial intestinal components control gut and lung injury after trauma hemorrhagic shock［J］.Ann Surg，2014，260 (6):1112-1120.

［9］ Liang HY，Chen T，Wang T，et al.Time course of intestinal barrier function injury in a sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis in rat model［J］.J Dig Dis，2014，15(7):386-393.

［10］Mu X，Pan C，Zheng S，et al.Protective effects of carbon monoxide-releasing molecule-2 on the barrier function of intestinal epithelial cells［J］.PLoS One，2014，9(8): e104032.

［11］Okorji UP，Velagapudi R，El-Bakoush A，et al.Antimalarial drug artemether inhibits neuroinflammation in BV2 microglia through Nrf2-dependent mechanisms［J］.Mol Neurobiol，2015 Nov 25.［Epub ahead of print］

［12］Wang D，Shi J，Lv S，et al.Artesunate attenuates lipopolysaccharide-stimulated proinflammatory responses by suppressing TLR4，MyD88 expression，and NF-κB activation in microglial cells［J］.Inflammation，2015，38(5):1925-1932.

［13］Hsieh CY，Osaka T，Moriyama E，et al.Strengthening of the intestinal epithelial tight junction by Bifidobacterium bifidum［J］.Physiol Rep，2015，3(3):e12327.

［14］Lei Q，Qiang F，Chao D，et al.Amelioration of hypoxia and LPS-induced intestinal epithelial barrier dysfunction by emodin through the suppression of the NF-κB and HIF-1α signaling pathways［J］.Int J Mol Med，2014，34(6): 1629-1639.

［15］Park HY，Kunitake Y，Hirasaki N，et al.Theaflavins enhance intestinal barrier of Caco-2 cell monolayers through the expression of AMP-activated protein kinase-mediated occludin，claudin-1，and ZO-1［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2015，79(1):130-137.

［16］Zhu C，Wu Y，Jiang Z，et al.Dietary soy isoflavone attenuated growth performance and intestinal barrier functions in weaned piglets challenged with lipopolysaccharide ［J］.Int Immunopharmacol，2015，28(1):288-294.

(責任編輯:林白霜，羅 森)

Artemisinin attenuates intestinal epithelial barrier damage induced by LPS

SUN Jun-bo1，ZHAO Lu2，SHI Su-qin3，KOU Zhen-yuan1，LIU Ai-juan2，FU Ting-ting2

(1Henan Province Hospital of TCM，The Second Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450002，China;2The Third Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450008，China;3The First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China.E-mail:junbosun@163.com)

AIM:To investigate the effect of artemisinin on lipopolysaccharide(LPS)-induced intestinal epithelial barrier damage in IEC-6 cells and its molecular mechanism.METHODS:Cultured IEC-6 cells were divided to 5 groups:control group，LPS(100 mg/L)group and LPS+Artemisinin(30，50 and 100 μmol/L)groups.The cytotoxicity was detected by MTT assay.The releases of TNF-α，IL-1β and IL-6 in the IEC-6 cells were measured by ELISA.The transepithelial electrical resistance(TER)was detected by electrical resistance tester，and the horseradish peroxidase (HRP)flux permeability were analyzed by a microplate reader.The expression of tight junction proteins，ZO-1，claudin-1 and occludin，and the expression of TLR4/MyD88/NF-κB at mRNA and protein levels were determined by RT-qPCR and Western blot.RESULTS:Artemisinin alone(up to 100 μmol/L)or in combination with LPS(100 mg/L)was not toxic to IEC-6 cells.Compared with control group，the releases of TNF-α，IL-1β and IL-6 in the culture supernatant of IEC-6 cells significantly increased after treatment with LPS.The expression of TLR4/MyD88/NF-κB was activated by LPS.LPS down-regulated the protein expression of ZO-1，claudin-1 and occludin.However，artemisinin treatment decreased the releases of TNF-α，IL-1β and IL-6 in the culture supernatant of IEC-6 cells.The expression of TLR4/MyD88/NF-κB at mRNA and protein levels was gradually reduced after treatment with artemisinin.In addition，artemisinin upregulated the protein expression of ZO-1，claudin-1 and occludin significantly(P＜0.01)in a dose-dependent manner.CONCLUSION: Artemisinin attenuates LPS-induced intestinal epithelial barrier damage by inhibiting TLR4/MyD88/NF-κB activation in the IEC-6 cells.

Artemisinin;Lipopolysaccharides;Intestinal epithelial cells

R574;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.021

1000-4718(2016)07-1285-06

2016-02-19

2016-04-07

△Tel:0371-60908899;E-mail:junbosun@163.com