MG132對SH-SY5Y細胞Aβ水平的影響*

王 浩， 孫利利， 于 楊， 楊艷茹， 馬 健， 陳 偉， 張繼國△， 秦樹存

(1泰山醫學院藥學院，山東泰安271016;2山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，泰山醫學院動脈粥樣硬化研究所，山東泰安271000)

MG132對SH-SY5Y細胞Aβ水平的影響*

王 浩1， 孫利利1， 于 楊2， 楊艷茹1， 馬 健1， 陳 偉1， 張繼國1△， 秦樹存2

(1泰山醫學院藥學院，山東泰安271016;2山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，泰山醫學院動脈粥樣硬化研究所，山東泰安271000)

目的:觀察蛋白酶體抑制劑MG132誘導SH-SY5Y細胞凋亡及調節β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)生成的作用，并對其機制進行探討。方法:培養SH-SY5Y細胞，MG132對細胞進行處理，濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，24 h后檢測各項指標。MTT法檢測細胞活力;流式細胞術檢測細胞凋亡; ELISA法檢測細胞Aβ1-40和Aβ1-42水平;Western blot檢測淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、β-分泌酶(BACE1)、早老蛋白1(presenilins 1，PS1)、早老蛋白2(presenilins 2，PS2)、nicastrin(NCT)和 α-分泌酶(ADAM10)蛋白表達。結果:經MG132處理后，細胞活力明顯下降，誘導細胞凋亡，隨劑量增加凋亡率分別為36.97%、46.20%、50.50%;細胞Aβ1-42和Aβ1-40蛋白水平明顯上升;APP及Aβ代謝相關蛋白PS1、PS2和BACE1表達均出現劑量依賴性的增加，而ADAM10表達呈劑量依賴性降低;NCT水平變化不明顯。結論:MG132能誘導神經細胞凋亡，通過影響Aβ生成途徑關鍵蛋白而促進Aβ的產生，說明蛋白酶體活性下降可通過調節Aβ途徑參與阿爾茨海默病的發生。

阿爾茨海默病;泛素-蛋白酶體系統;MG132;β-淀粉樣蛋白;細胞凋亡

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是中樞神經系統退行性疾病，隨著社會人口老齡化加劇，發病率逐年增高，其發病機制尚不明確，也缺乏有效的治療措施［1］。而淀粉樣蛋白級聯假說認為，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是AD發病的關鍵分子［2］。泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核細胞重要的細胞內蛋白質質量控制系統，具有調控特定蛋白質和去除錯誤折疊或其它不正常折疊蛋白質的重要功能，近年研究發現，UPS可能調節Aβ代謝，進而在AD發病過程起著重要作用［3-4］，但其確切的作用及機制還未完全闡明。本課題組采用蛋白酶體抑制劑MG132抑制蛋白酶體活性，處理人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，觀察UPS受抑后對細胞活力、細胞凋亡，Aβ生成的影響，并初步探討其機制，以期為闡明UPS在AD中的作用提供依據。

材料和方法

1 細胞

人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y購于上海生命科學研究所。

2 主要試劑和儀器

蛋白酶體MG132(Sigma);完全1640培養基和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司);胎牛血清(杭州四季青公司);Aβ1-40和Aβ1-42ELISA試劑盒(藍基生物公司);APP、BACE1、ADAM10、PS1、PS2和NCT抗體(Abcam)。CO2培養箱(SANYO);多功能酶標儀(Tecan INFINITE200);垂直電泳儀、電泳槽及轉膜系統(Bio-Rad);流式細胞儀(BD)。

3 主要方法

3.1 細胞培養及給藥 SH-SY5Y細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO2的培養箱中培養，當細胞生長到80%融合時給藥，給藥處理24 h。除MTT實驗中MG132濃度為1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和15 μmol/L外，其余實驗均為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L。空白對照組給予等量的DMEM培養基。

3.2 MTT實驗檢測細胞活力［5］細胞培養于96孔板中，給藥處理后，去培養基，每孔加入含MTT的培養基繼續培養4 h，MTT終濃度為0.5 g/L，4 h后去除培養基，每孔加入DMSO 100 μL，室溫搖床振蕩10 min，酶標儀檢測其吸光度，波長為490 nm，每組重復3孔。

3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞培養于6孔板中，給藥處理后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集細胞，PBS清洗2次，離心去上清。500 μL緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為5×108/L，依次加入5 μL PI和5 μL Annexin V，5 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。每組重復3孔。

3.4 ELISA檢測細胞Aβ1-40和Aβ1-42水平［6］細胞培養于6孔板中，給藥處理后留取上清，用于測定Aβ1-40和Aβ1-42水平;胰酶消化后收集細胞，PBS清洗2次，采用反復凍融法裂解細胞，收集裂解液用于測定細胞內Aβ1-40和Aβ1-42水平，計算時將上清液及細胞裂解液中Aβ1-40和Aβ1-42含量分別相加，作為Aβ1-40和Aβ1-42的總含量。根據ELISA試劑盒說明書，采用競爭酶聯免疫測定技術，樣品與Aβ-HRP親和素在預先包被抗人Aβ抗體的酶標板孔里，37℃反應1 h，然后再與HRP酶底物共同孵育，加入終止液后于酶標儀450 nm處測定吸光度。每組重復3孔。

3.5 Western blot檢測蛋白水平［7］細胞培養于6孔板中，給藥處理后，胰酶消化收集細胞，預冷PBS 洗2次，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，冰上放置30 min，4℃ 12 000×g離心20 min，收集上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，相關Ⅰ抗室溫孵育2 h，4℃過夜，Ⅱ抗室溫孵育2 h，ECL于顯影儀中曝光顯影，實驗重復3次。以β-actin為內參照，進行半定量分析，比值表示其相對量。

4 統計學方法

用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，數據用(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 MG132降低SH-SY5Y細胞活力

MTT實驗結果顯示，與空白對照組相比，加入MG132后的SH-SY5Y細胞活力明顯下降(P＜0.01)，隨著濃度的增加細胞活力分別下降了38.00%、47.22%、51.17%、52.00%和52.98%，表明MG132對SH-SY5Y細胞具有明顯損傷作用，見圖1。

Figure 1.MG132 reduced the viability of SH-SY5Y cells.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖1 MG132降低SH-SY5Y細胞活力

2 MG132誘導SH-SY5Y細胞凋亡

流式細胞術結果顯示，與空白對照組相比，MG132各濃度(2.5、5和10 μmo/L)組早期凋亡率和晚期凋亡率都明顯增加，總凋亡率分別為36.97%、46.20%和50.50%，相比空白對照組的6.31%明顯升高，說明MG 132能明顯誘導SH-SY5Y細胞凋亡，見圖2。

3 MG132提高SH-SY5Y細胞Aβ1-40和Aβ1-42的水平

與空白對照組比較，MG132各濃度組總的Aβ1-40和Aβ1-42水平都明顯增高，且具有一定的劑量依賴性，說明MG132可提高Aβ水平，見圖3。

Figure 2.MG132 induced the apoptosis of SH-SY5Y cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 MG132誘導SH-SY5Y細胞凋亡

Figure 3.MG132 increased the level of Aβ in the SH-SY5Y cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖3 MG132提高SH-SY5Y細胞Aβ1-40和Aβ1-42水平

4 MG132調節與Aβ生成相關蛋白的表達

Aβ由APP水解產生，其水解酶為BACE1和γ-分泌酶［8］。與空白對照組相比，給予MG132后，APP 和BACE1蛋白表達明顯增多。γ分泌酶是由4個亞基組成的復合蛋白，其中發揮重要作用的為PS1、PS2 和NCT［8］。與空白對照組相比，給予MG132后PS1 和PS2蛋白表達都明顯增加，NCT雖然表達也有所增加，但無顯著性統計學差異。ADAM10是使APP經非淀粉樣途徑水解的主要酶，經此途徑水解不產生Aβ［8］。與空白對照組相比，給予 MG132后，ADAM10表達明顯下降，見圖4。

討論

UPS是廣泛存在于細胞內的一種蛋白質降解途徑，對于維持各種細胞功能具有重要意義。UPS系統由泛素、泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme，E1)、泛素結合酶(ubiquitin conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶(ubiquitin ligase enzyme，E3)和26S蛋白酶體構成，其中酶主要負責底物蛋白的泛素化，而26S蛋白酶體負責識別泛素分子標記的蛋白底物并將其降解［9］。研究發現，UPS異常與多種神經變性疾病相關，如帕金森病、AD等［10］。尤其是UPS與AD的相關性，越來越受到研究者的關注。有研究發現在AD患者腦組織中蛋白酶體活性明顯下降，尤其是與學習記憶密切相關的海馬區;AD患者2個重要的病理學改變［由Aβ形成的老年斑(senile plaque，SP)和由磷酸化Tau蛋白形成的神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)］中泛素積聚［11-12］;也有研究發現泛素系統的紊亂及蛋白質質量控制系統的損害是AD發生的早期事件［13］;說明UPS失調在AD發生過程中可能起著重要作用。所以有學者認為AD是蛋白質錯誤折疊性疾病，蛋白質質量控制失衡是導致AD發生直接或間接原因［14］。因此本課題組利用蛋白酶體活性抑制劑MG132對UPS在AD中的作用進行了研究，發現MG132處理SH-SY5Y細胞后，細胞活力隨著MG132濃度的增高明顯下降，細胞凋亡明顯增加，表明蛋白酶體活性下降能誘導細胞損傷，說明正常的蛋白酶體活性是維持神經細胞活力及功能的重要因素。

Figure 4.The effect of MG132 on the expression of the related proteins for Aβ generation in the SH-SY5Y cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖4 MG132影響與SH-SY5Y細胞Aβ生成相關蛋白的表達

基于Aβ建立的淀粉樣蛋白級聯假說認為Aβ在腦內沉積是AD病理改變的中心環節，可引發一系列病理過程，這些病理過程又進一步促進Aβ沉積，從而形成一種級聯式放大效應［15］。而有研究發現UPS在Aβ的生成和代謝中發揮重要作用，可調控Aβ的水平［16］。在本研究中經不同濃度的MG132處理SH-SY5Y細胞后，Aβ1-40及Aβ1-42的水平都明顯升高，也證實了此觀點。同時本研究還對UPS系統調控Aβ水平的機制進行了初步研究。

Aβ是由APP通過酶降解產生［8，17］。APP的降解包括淀粉樣肽源途徑和非淀粉樣肽源途徑。淀粉樣肽源途徑是指APP在腦內經β-分泌酶和γ-分泌酶的作用生成具神經毒性的Aβ片段，非淀粉樣肽源途徑是指APP在α-分泌酶(如ADAM10)和γ-分泌酶的作用下從Aβ序列內部進行降解，生成sAPPα而避免Aβ的生成。生理狀態下，APP主要經非淀粉樣途徑水解，少量經淀粉樣途徑產生 Aβ，而且sAPPα還具有神經營養和神經保護作用。而本研究發現，給予MG132后，BACE1水平明顯升高，ADAM10水平則明顯下降，說明UPS功能下降可改變生理的APP降解途徑，使其更多的經淀粉樣肽源途徑降解。同時本研究也發現，給予MG132后APP水平明顯升高，說明APP也可通過UPS系統進行降解，這與Shen等［5］的研究結論相符。本研究還對蛋白酶體活性被抑制后γ-分泌酶蛋白表達進行了研究，研究發現MG132明顯提高γ-分泌酶蛋白復合物中活性蛋白PS1和PS2的表達，而對NCT的影響不明顯。說明蛋白酶體活性降低引起的Aβ水平升高，可能也與UPS系統參與γ-分泌酶的代謝有關。

總之，本實驗結果表明抑制蛋白酶體活性，可誘導神經細胞損傷和Aβ水平上升，其機制可能與其調節與Aβ生成相關的底物APP及α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶相關組分有關，但對其深入的分子機制還有待進一步研究。

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(責任編輯:陳妙玲，羅 森)

Effect of MG132 on Aβ generation in SH-SY5Y cells

WANG Hao1，SUN Li-li1，YU Yang2，YANG Yan-ru1，MA Jian1，CHEN Wei1，ZHANG Ji-guo1，QIN Shu-cun2

(1School of Pharmaceutical Science，Taishan Medical University，Taian 271016，China;2Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities of Shandong，Institute of Atherosclerosis，Taishan Medical University，Taian 271000，China.E-mail:jgzhang@tsmc.edu.cn;shucunqin@hotmail.com)

AIM:To observe the influences of different concentrations of MG132 on apoptosis and beta-amyloid protein(Aβ)generation in SH-SY5Y cells，and to explore the underlying mechanism.METHODS:SHSY-5Y cells were incubated with MG132 for 24 h.The final concentrations of MG132 were 2.5，5 and 10 μmol/L.The cell viability was determined by MTT assay.The cell apoptosis was assessed by flow cytometry.The levels of Aβ were measured by ELISA.The relative protein levels were detected by Western blot.RESULTS:In the SH-SY5Y cells，MG132 reduced the cell viability，induced the cell apoptosis，increased the level of Aβ，and increased the expression of the related proteins for Aβ generation in a concentration-dependent manner.CONCLUSION:MG132 induces apoptosis and increases the levels of Aβ1-42and Aβ1-40by regulating the proteins related to Aβ generation in the SH-SY5Y cells.

Alzheimer’s disease;Ubiquitin-proteasome system;MG132;Beta-amyloid protein;Apoptosis

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.007

1000-4718(2016)07-1195-05

2015-12-08

2016-02-29

國家自然科學基金資助項目(No.81441111;No.81302202);山東省自然科學基金資助項目(No.ZR2011HM044);山東省衛生廳資助項目(No.2013WS0313);泰安市科技計劃資助項目(No.2015NS2072)

△張繼國 Tel:0538-6229836;E-mail:jgzhang@tsmc.edu.cn;秦樹存 Tel:0538-6222986;E-mail:shucunqin@hotmail.com