脂溶性蟾毒配基的純化工藝研究

王艷華 段佳林 衛國 朱艷榮 殷英 郭超 關月 奚苗苗 文愛東 翁琰

【摘 要】 目的：研究從蟾酥中提取分離高純度蟾毒靈（B）、華蟾酥毒基（C）和脂蟾毒配基（R）的純化工藝條件。方法：以三種蟾毒配基的總含量和轉移率為考察指標，采用單因素考察法，結合蟾酥藥材的特點、化學成分及工藝成本等多方面的綜合因素，考察蟾酥藥材的提取、萃取及硅膠柱層析分離的具體工藝條件及參數。結果：蟾酥藥材經10倍量（v/m）80%乙醇加熱回流1h，再用10倍量（v/m）乙酸乙酯萃取3次，最后用硅膠柱層析進行分離后，三種蟾毒配基的總含量可達92.26%，總轉移率為80.54%。結論：此法能很好地從蟾酥中分離純化蟾毒配基，大大提高了三個蟾毒配基的純度。

【關鍵詞】 蟾毒配基；含量；轉移率；提取；萃取；硅膠柱層析

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）13-0015-03

Abstract：Objective To study on the purification technology of Chansu in order to obtain the high purity ofbufalin （B）， cinobufagin （C） and resibufogenin （R）. Methods The single factor investigation method， combining with comprehensive factors such as the characteristics of raw material， chemical composition and technological cost was used to investigate the detailed conditions and parameters of extraction， separation and silica gel column chromatographyltechnologies with the content and the transfer rate of three bufadienolides as index.Results The final separated products contained a high purity of 92.26% for a sum of B， C and R and a high total transfer rate of 80.54% after the raw materials were separated by 10-fold （v/m） 80% ethanol reflux extraction for 1h， 10-fold （v/m） ethyl acetate extraction for 3 times and loaded on silica gel columnchromatography. Conclusion Bufadienolides could be well separated from the raw material of Chansu， and the purityof bufadienolides could be greatly improved with this method.

Keywords： bufadienolides； content； transfer rate； extraction； separation； silica gel column chromatography

蟾酥是我國的傳統中藥材，由蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarzinas Gantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的皮膚腺及耳后腺分泌的白色漿液加工干燥而成[1]，具有興奮呼吸、致幻、鎮痛、強心、升壓、抗休克、局部麻醉、鎮咳、抗腫瘤等一系列的藥理活性[2]，其化學成分按溶解性能不同分為脂溶性和水溶性兩大類。雖然脂溶性成分僅占20%左右，但在發揮藥理活性方面卻起主導作用，其中又以蟾毒靈（bufalin，B）、華蟾酥毒基（cinobufagin， C）和脂蟾毒配基（resibufogenin， R）含量較多、活性較強，且具有高效低毒的特點。目前蟾酥的提取工藝研究報道很多[3-6]，但對蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基進行提取和純化并提高三種蟾毒配基混合物純度的研究并不多。研究以三種蟾毒配基的總含量和轉移率為考察指標，采用單因素試驗系統研究了蟾酥的提取純化工藝，旨在得到高純度的三種蟾毒配基混合物，為工業化生產提供了一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日立D-7000高效液相色譜儀（L-7100 泵、L-7420紫外檢測器、L-7200自動進樣器，日本Hitachi公司）；HiQ sil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， 日本KYATECH公司）；AT-130柱溫箱（天津市鑫洲科技有限公司）；FA1104N電子分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；FW-100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DZ-1BC真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；玻璃柱（5 cm×90 cm，第四軍醫大學玻璃儀器制備室）。

1.2 材料 蟾酥（安徽省毫州市中藥飲片廠）；蟾毒靈對照品（批號：1054-070211，中藥固體制劑制造技術國家工程中心）；華蟾酥毒基對照品（批號：110803-200605）、脂蟾毒配基對照品（批號110718-200507）購自中國藥品生物制品檢定所；柱層析用硅膠（100-140目，200-300目）、薄層層析用硅膠G（青島海洋化工廠）。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 蟾毒配基的薄層色譜法鑒別 取蟾毒靈、華蟾酥毒基與脂蟾毒配基對照品，加甲醇分別制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液；再取蟾酥分離物細粉12mg，加甲醇稀釋并定容至10mL量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015版一部附錄VIB）試驗，吸取上述溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-三氯甲烷-丙酮（4∶ 3∶ 3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。

2.2 蟾毒配基的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：HiQ sil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5μm）；預柱：Fusion-RP 4 mm×3.0 mm；流動相：乙腈-0.5%磷酸二氫鉀溶液（45∶55； pH： 3.2）；流速：1mL/min；檢測波長：296nm；柱溫：40℃；進樣量：10μL；理論塔板數以蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰計算均不低于4000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取經五氧化二磷干燥至恒重的蟾毒靈與華蟾酥毒基對照品各3mg、脂蟾毒配基對照品5mg分別置10mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得三種蟾毒配基單獨的對照品儲備液；分別精密量取1.0mL單獨的對照品儲備液，置同一個10mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得三種蟾毒配基混合的對照品儲備液；精密量取1.5mL混合對照品儲備液，置5mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得理論上每1mL分別含蟾毒靈與華蟾酥毒基9μg、脂蟾毒配基15μg的對照品溶液。

2.2.3 標準曲線的考察 分別精密量取“2.2.1”項下三種蟾毒配基混合的對照品儲備液0.2、0.5、0.75、1.5、2.5mL置5mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻。分別精密吸取稀釋后的溶液及混合對照品儲備液10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品溶液峰面積對濃度作圖，蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的線性關系回歸方程分別為：A1= 6287.7 C1- 664.1，r1=0.9999；A2 = 6957.6 C2- 2102.2，r2=0.9997；A3= 6535.6 C3-2751.2，r3=0.9998。結果表明：蟾毒靈與華蟾酥毒基均在1.2～30.0μg、脂蟾毒配基在2.0～50.0μg范圍內濃度與峰面積線性關系良好。

[JP3]2.2.4 供試品溶液的制備 精密稱定蟾酥提取物或萃取物細粉約25mg，置圓底燒失的重量，搖勻，經0.45μm濾膜過濾，分別精密量取2.0、1.5及0.5mL續濾液置10mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

分離物供試品溶液精密稱定蟾酥分離物5mg置10mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1.0mL置10mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經0.45μm微孔濾膜過濾即得。

2.3 提取工藝的考察

2.3.1 提取溶劑的選擇 稱取小于60目的蟾酥藥材細粉5g，分別采用10倍量（v/m）的氯仿或70%、80%和90%乙醇加熱回流1h，放冷至室溫，抽濾，濾液蒸干，濾液干燥物及殘渣置真空干燥箱干燥12h，按2.2項下方法測定提取物中蟾毒配基的含量。結果表明，隨著乙醇濃度的增大，提取物中蟾毒配基總含量從22.01%增加到30.18%，而轉移率從85.24%降到76.36%；使用索氏提取器以氯仿為溶劑進行提取時，雖然干燥物中三種蟾毒配基的總含量可達到61.89%，但提取轉移率小于60%。綜合考慮，乙醇為中藥提取中最常用的溶劑，具有價廉、易得、安全、無毒、無污染等特點，因此本試驗選擇80%乙醇為提取溶劑。

2.3.2 粉末粒度的確定 在試驗操作中所采用的粉碎機可在短時間內將藥材粉碎到粒徑小于60目，其中多數分布在80～100目，因此我們僅對60～80目，80～100目及小于100目的細粉進行了考察。稱取這三種粒度的蟾酥藥材細粉各5g，采用10倍量（v/m）80%乙醇加熱回流1h，放冷置室溫，抽濾，濾液蒸干，濾液干燥物置真空干燥箱干燥12h，按“2.2”項下方法測定提取物中三種蟾毒配基的含量。結果表明：三種蟾毒配基的總含量和總提取率沒有明顯差異，均在27%和84%左右。因此確定將蟾酥藥材粉碎到粒度小于60目。

2.3.3 提取回流時間的確定 稱取小于60目的蟾酥藥材細粉5g，采用10倍量（v/m）80%乙醇分別加熱回流0.5、1、2h，放冷至室溫，抽濾，濾液蒸干，濾液干燥物置真空干燥箱干燥12h，按2.2項下方法測定提取物中三種蟾毒配基的含量。結果表明：當提取時間小于1h時，提取物中三種蟾毒配基的純度及轉移率較低，但超過1h時，又均未有明顯增加。因此確定回流時間為1h。

2.3.4 提取工藝驗證 實驗將蟾酥藥材粉碎到粒徑小于60目，稱取此細粉三份，每份5g，采用10倍量（v/m）80%乙醇加熱回流1h，放至室溫后，抽濾，濾液蒸干，濾液干燥物置真空干燥箱干燥12h后，按“2.2”項下方法測定干燥物中指標性成份的含量及轉移率。結果見表1。

2.4 萃取工藝的考察

2.4.1 萃取溶劑的選擇 稱取蟾酥醇提物 5g，加入10倍量（v/m）的蒸餾水超聲混懸后，再分別用10倍量（v/m）的乙醚、氯仿或乙酸乙酯萃取3次，合并有機層并將其蒸干，所得干燥物置真空干燥箱干燥12h后，按“2.2”項下方法測定萃取物中指標性成份的含量及轉移率。結果發現：對提取物使用乙醚、氯仿或乙酸乙酯等極性較小的溶劑萃取后，蟾毒配基的總含量提高了近一倍，均在55%左右，但乙醚和氯仿的萃取轉移率均小于80%，而乙酸乙酯可達到90%以上。加之使用乙醚極易發生乳化現象，同時考慮到溶劑的毒性，最終選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑，進一步考察其用量。

2.4.2 萃取溶劑用量的考察 稱取蟾酥醇提物 5 g，加入10倍量（v/m）的蒸餾水超聲混懸后，再分別用5、10、20倍量（v/m）的乙酸乙酯萃取3次，合并有機層并將其蒸干，所得干燥物置真空干燥箱干燥12h后，按“2.2”項下方法測定萃取物中指標性成份的含量及轉移率。結果表明：使用不同用量的乙酸乙酯均能有效地對指標性成分進行萃取，但在操作中使用五倍量的蒸餾水混懸醇提物較困難，固狀物不能充分混懸，操作不便，同時考慮到節省溶劑，最終選用10倍量的乙酸乙酯進行萃取。

2.4.3萃取工藝驗證 實驗稱取蟾酥醇提物 20 g，加入10倍量（v/m）的蒸餾水超聲混懸后，再分別用10倍量（v/m）的乙酸乙酯萃取3次，合并有機層并將其蒸干，所得干燥物置真空干燥箱干燥12h后，按“2.2”項下方法測定萃取物中指標性成份的含量及轉移率，結果見表2。

2.5 硅膠柱層析工藝的考察

2.5.1 柱層析條件 自制玻璃（D-5 cm， H-8 cm），玻璃柱（5 cm×90 cm），層析用硅膠，展開劑：環己烷、丙酮、三氯甲烷。

2.5.2 硅膠柱裝柱及層析分離 稱取250g硅膠（200～300目），用環己烷分散均勻后，裝柱并沉降過夜。稱取蟾酥萃取物10g溶于150mL氯仿與甲醇（1∶1）中，濾去不溶物，將澄清液邊加邊攪拌于50g硅膠（100～140目）中拌樣，放置待完全干燥后，裝入已經沉降一晚的硅膠柱頂，上面再加入保護硅膠和無水硫酸鈉。洗脫時，先用環己烷：丙酮（10∶1）洗脫3個體積，再用環己烷：丙酮（5∶1）洗脫5個體積，然后用丙酮洗脫3個體積，最后用甲醇洗脫至目標成分消失。洗脫過程中，分段收集餾分，利用減壓蒸餾對餾分進行濃縮，并用薄層色譜法對濃縮物進行鑒別。由鑒別結果可知伴隨第二個黃色帶洗脫下來時，開始得到的白色固體即為指標成分。分離結束后合并經分析較純的蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基，并對合并物按“2.2”項下方法進行定量分析，結果見表3。

3 討論

3.1 提取方法的確定 國內雖有多篇文獻報道了蟾酥中蟾毒配基的提取方法，但多數是為了分離少量試驗樣品，因此考慮不是很全面，存在著各種問題。研究綜合文獻的優缺點，使用回流提取法以乙醇為溶劑對蟾酥中脂溶性成分進行提取。

該法簡便，省時，溶劑用量較少，同時使用萃取工藝對蟾毒配基進行富集，最終萃取物中三種目標化合物的純度和在50%以上，轉移率在90%以上，為工業化放大奠定了一定實驗基礎。

3.2 純化工藝的選擇 蟾毒靈、華蟾酥毒基及脂蟾毒配基屬于強心苷成分，極性較小不適合用大孔樹脂來分離。若將這三種蟾毒配基的純品于環己烷-丙酮中用中性氧化鋁吸著，經1～3d即起吸附劑副反應，綜合比較使用硅膠柱分離效果較好[7]。研究使用濕柱層析法，進行梯度洗脫，可一次性將三種蟾毒配基從萃取物中進行分離，最終蟾酥分離物中三種蟾毒配基的含量和達到了92.26%，轉移率為80.54%。在實驗室工藝放大過程中，可適量增加上樣量，減少分離硅膠的使用，多次層析分離后可將每根層析柱的少量交叉部分合并，再次上柱層析分離，可使純化效率提高同時也保證了蟾毒配基的轉移率。

參考文獻

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（收稿日期：2016.05.03）