miR-21對人喉鱗癌細胞Hep2遷移侵襲能力的影響

劉永軍，管艷飛,常　順

(云南省第一人民醫院:1.耳鼻喉科;2.神經外科，昆明 650032)

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miR-21對人喉鱗癌細胞Hep2遷移侵襲能力的影響

劉永軍1，管艷飛1,常順2△

(云南省第一人民醫院:1.耳鼻喉科;2.神經外科，昆明 650032)

目的探討微小RNA-21(miR-21)對人喉鱗癌細胞Hep2遷移、侵襲能力的影響。方法用脂質體LipofectamineTM2000將miR-21抑制劑和miR-21 NC轉入人喉鱗癌細胞Hep2中，48 h后，運用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測細胞活力，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，Transwell小室法檢測細胞侵襲能力，蛋白質印跡法檢測人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)的激活情況，以及基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9與伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白(RECK)的表達。結果與miR-21 NC比較，miR-21 抑制劑能明顯降低Hep2細胞活力[(0.688±0.043)vs.(0.375±0.012)]，抑制細胞遷移能力[(6.57±0.02)μmvs.(20.49±2.18)μm]及細胞侵襲能力[(100.7±10.2)vs.(46.8±4.3)]，差異均有統計學意義(P<0.01)；同時miR-21 抑制劑能明顯下調PI3K、MMP2及MMP9的表達(P<0.01)，降低Akt的磷酸化水平(P<0.01)，并上調PTEN及RECK的表達(P<0.01)。結論miR-21 抑制劑能明顯抑制人喉鱗癌細胞Hep2的遷移、侵襲能力，可能與PTEN/PI3K/Akt信號通路有關。

微小RNA-21；人喉鱗癌Hep2細胞；遷移；侵襲

喉鱗癌是我國常見的頭頸部惡性腫瘤，占頭頸部腫瘤的14%左右，其中喉鱗狀細胞癌是其主要病理類型，占90%以上。喉鱗癌的主要治療方式為手術治療，輔以化療和放射治療，但對中晚期患者預后及5年生存率效果欠佳，主要原因是惡性腫瘤的侵襲轉移，并最終導致患者死亡[1-2]。而且喉鱗癌的發病機制尚未清楚，吸煙、飲酒、病毒感染、空氣污染及癌基因的激活與抑癌基因的失活都可能是其病因[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是目前新發現的一類癌基因或抑癌基因，并與腫瘤的發生、發展密切相關，在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲轉移中起重要作用[3]。已證實微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)是唯一一個在已檢測的惡性腫瘤中均表達上調的miRNA，在腫瘤中發揮著癌基因作用[4-5]。此外，通過miRNA芯片技術也證實48對喉鱗狀細胞癌標本中包括miR-21在內的4個miRNA表達水平上調[6]。同時也發現喉鱗狀細胞癌患者血清miR-21表達水平明顯過高，并與淋巴結轉移密切相關，且可作為喉鱗狀細胞癌標記物及預后的獨立因子[7]。充分說明miR-21在喉鱗癌中過表達，并與喉鱗癌的發生、發展密切相關。因此，探討miR-21在喉鱗癌發生、發展過程中的作用，具有重要的理論意義。所以，本研究擬通過下調人喉鱗癌細胞Hep2中miR-21的表達，探討其對Hep2細胞遷移、侵襲能力的影響及具體機制，從而為喉鱗癌的早期診斷及預后判斷提供新思路。

1　材料與方法

1.1細胞株來源人喉鱗癌細胞Hep2購自中國科學院細胞庫(目錄號：TCHu21)。

1.2儀器與試劑四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國Gibco公司)，miR-21抑制劑和miR-21 NC(上海吉瑪制藥技術有限公司)；張力蛋白同源的基因(PTEN)，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，蛋白激酶B(Akt)，伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白(RECK)，基質金屬蛋白酶(MMP)2，MMP9(美國Epitomics公司)；胎牛血清，達氏修正依氏培養基(DMEM，美國Hyclone公司);三磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH，碧云天生物技術有限公司)。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)，TS100倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3方法

1.3.1MTT比色法檢測Hep2細胞活力將人喉鱗癌細胞Hep2接種于96孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-21 抑制劑和miR-21 NC。48 h后，加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續培養4 h后吸棄培養液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，震蕩使結晶物充分溶解，于酶標儀560 nm處測吸光度值(A值)，以A值表示細胞相對活力。

1.3.2劃痕實驗將人喉鱗癌細胞Hep2接種于6孔板，當細胞匯合度達到50%時，用移液器槍頭沿培養板底部呈“一”字型劃痕單層細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌被刮下的細胞，更換培養基后，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-21 抑制劑和miR-21 NC。48 h后，倒置顯微鏡下觀察Hep2細胞向劃痕區域的遷移距離并拍照。

1.3.3Transwell侵襲實驗將基質膠(matrigel)均勻平鋪于Transwell小室的微膜(8 μm)上，制成凝膠備用。將人喉鱗癌細胞Hep2接種于6孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-21 抑制劑和miR-21 NC。48 h后，將細胞消化加入Transwell上室，下室用含5%胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養24 h，取出Transwell小室，洗滌，多聚甲醛固定，結晶紫染色，被染色的細胞質呈紫色，倒置光學顯微鏡下計數5個視野穿膜細胞個數，計算平均每個視野的細胞數，即表示細胞的侵襲能力。每組實驗重復3次。

1.3.4蛋白質印跡法(Western blotting)將人喉鱗癌細胞Hep2接種于6孔板，當細胞匯合度達到50%時，用LipofectamineTM2000分別轉染miR-21 抑制劑和miR-21 NC。48 h后消化收集細胞，加入放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解液，每隔10 min置于渦旋儀中震蕩30 s，40 min后4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，即可獲得總蛋白。根據二喹啉甲酸(BCA)試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳，后濕法轉膜。將膜浸入一抗溶液孵育，4 ℃過夜；漂洗后，浸入二抗溶液中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加電化學發光(ECL)曝光液，在凝膠成像系統中曝光。用Quantity One軟件對各抗體條帶灰度值進行統計。

2　結　　果

2.1miR-21 抑制劑對人喉鱗癌Hep2細胞活力的影響Hep2細胞轉染miR-21 抑制劑和miR-21 NC 48 h后，經MTT比色法發現，細胞轉染miR-21 抑制劑其A值(0.375±0.012)低于轉染miR-21 NC的(0.688±0.043)，差異有統計學意義(P<0.01)，表明miR-21 抑制劑能明顯抑制Hep2細胞活力。

2.2miR-21 抑制劑對人喉鱗癌Hep2細胞遷移侵襲能力的影響與miR-21 NC比較，miR-21 抑制劑能明顯抑制人喉鱗癌Hep2細胞的遷移、侵襲能力，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖1、2及表1。

A：miR-21 NC；B：miR-21 抑制劑。

圖1miR-21 抑制劑對人喉鱗癌Hep2細胞遷移能力的影響(×100)

A：miR-21 NC；B：miR-21 抑制劑。

圖2　　miR-21 抑制劑對人喉鱗癌Hep2細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色，×200)

*：P<0.01，與miR-21 NC比較。

2.3miR-21 抑制劑對人喉鱗癌Hep2細胞中MMPs及RECK蛋白表達的影響與miR-21 NC比較，miR-21 抑制劑能明顯下調人喉鱗癌Hep2細胞中MMP2、MMP9的表達，上調RECK的表達，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖3、表2。

圖3　　miR-21 抑制劑對人喉鱗癌Hep2細胞中MMPs及RECK蛋白表達的影響

組別MMP2/GADPHMMP9/GADPHRECK/GADPHmiR-21NC1.089±0.0840.997±0.0780.283±0.010miR-21抑制劑0.342±0.020*0.305±0.026*0.975±0.064*

*：P<0.01，與miR-21 NC比較。

2.4miR-21 抑制劑對人喉鱗癌Hep2細胞中PTEN/Akt信號通路的影響與miR-21 NC比較，miR-21 抑制劑能明顯下調人喉鱗癌Hep2細胞中PI3K的表達及Akt磷酸化水平，上調PTEN的表達，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖4、表3。

圖4　miR-21 抑制劑對人喉鱗癌Hep2細胞中PTEN/Akt信號通路的影響

組別PTEN/GADPHPI3K/GADPHp-Akt/AktmiR-21NC0.287±0.0110.502±0.0461.007±0.104miR-21抑制劑1.009±0.097*0.133±0.012*0.169±0.020*

*：P<0.01，與miR-21 NC比較。

3　討　　論

miRNAs是一類進化上高度保守的內源性非編碼小分子RNA，它能夠結合于靶基因mRNA的3′-UTR區域，阻遏靶基因的翻譯，從而抑制靶基因表達。miR-21是2001年在非脊椎動物和脊椎動物中發現的第一個miRNA，隨后在小鼠的神經元細胞及Hela細胞中也分別檢測到，其具有較強的組織特異性，與多種實體腫瘤的發生、發展密切相關，在喉鱗癌中也表達異常，并呈上調趨勢。如Kalfert等[5]對51例頭頸部鱗狀細胞癌組織(23例咽癌、24例喉癌、4例鼻咽癌)及正常鱗上皮組織進行實時熒光定量PCR(RT-PCR)分析，結果發現miR-21在所有癌組織中表達水平都明顯上調。Cao等[6]進一步通過miRNA芯片也證實48對喉鱗狀細胞癌標本中包括miR-21在內的4個miRNA表達水平上調。Wang等[7]檢測52例喉鱗狀細胞癌患者及52例聲帶息肉患者血清中miR-21的表達，發現喉鱗狀細胞癌患者血清miR-21表達水平明顯過高，并與淋巴結轉移密切相關，其可作為喉鱗狀細胞癌標記物及預后的獨立因子。此外，Liu等[8]也證實喉鱗癌中miR-21過表達，且高表達的miR-21與臨床分期、病理分化及淋巴結轉移密切相關，說明miR-21在喉鱗癌細胞中起致癌miRNA的作用，并與喉癌淋巴結轉移密切相關。因此，本研究在此基礎上探討miR-21對人喉鱗癌細胞Hep2遷移、侵襲的作用。

Reis等[9]證實RECK是miR-21的下游靶基因，miR-21能靶向下調RECK，且RECK的低表達導致了MMP9的高表達，從而促進胰腺癌細胞的侵襲。左文娜[10]證實RECK在喉癌組織中低表達，并與喉癌的發生、發展、分化及淋巴結轉移密切相關。RECK是一種新型的MMPs抑制劑，可在轉錄后水平明顯抑制多種MMPs的表達，從而抑制腫瘤的侵襲轉移及血管生成。MMPs是降解細胞外基質的最重要的蛋白水解酶，其中MMP2不僅可以降解細胞外基質中的明膠Ⅳ型膠原等，還可以通過新生毛細血管促進腫瘤的侵襲及轉移。MMP9是MMPs中相對分子質量最大的酶，能夠降解細胞外基質和基底膜，從而增加細胞的運動能力，促進腫瘤的擴散和轉移。吳春芳等[11]證實，MMP2在喉癌組織中的陽性率明顯高于癌旁組織，并與分化程度及臨床分期密切相關。劉玉東等[12]證實MMP9在喉癌組織中的陽性率明顯高于癌旁組織，并與腫瘤的發生、發展密切相關。因此，上調RECK表達，下調MMP2及MMP9的表達，能在一定程度上抑制細胞外基質破壞，抵抗腫瘤細胞侵襲。本研究結果恰好證實了miR-21 抑制劑可以明顯地上調RECK的表達，下調MMP2及MMP9的表達，從而抑制Hep2細胞的侵襲、遷移能力。

腫瘤的侵襲、轉移等生物學行為與多種信號通路有關，PTEN/PI3K/Akt就是其中的一種。已證實PTEN是miR-21的下游靶基因，PTEN在在眾多腫瘤中表達缺失或突變。PTEN在喉鱗癌中低表達，并與腫瘤分期、腫瘤范圍及淋巴結轉移密切相關，且miR-21與PTEN呈負相關[8]。PTEN能將三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化為二磷酸脂酰肌醇(PIP2)，從而負調控PI3K/Akt信號通路，負調節細胞生長、凋亡、遷移侵襲等生物學行為。PI3K/Akt信號通路與多種人類腫瘤的發生、發展密切相關，能通過下游多種靶蛋白表達，從而參與調控腫瘤細胞的生長、凋亡、周期調控，血管生成，侵襲轉移等過程。已報道，PI3K/Akt在喉鱗癌中異常激活[13]。孫吉春等[14]證實，miR-21 抑制劑能明顯抑制PTEN/PI3K/Akt信號通路，從而抑制胰腺癌細胞的侵襲轉移。miR-21 抑制劑能明顯抑制人舌鱗狀細胞癌的增殖及侵襲能力[15]。本研究結果也表明，miR-21 抑制劑能明顯上調PTEN表達水平，下調PI3K表達水平及Akt磷酸化水平。從而說明，miR-21能通過PTEN/PI3K/Akt信號通路影響喉鱗癌Hep2細胞的遷移、侵襲能力。

綜上所述，miR-21 抑制劑能明顯抑制人喉鱗癌細胞Hep2的遷移、侵襲能力，可能與上調RECK表達，下調MMPs表達，以及PTEN/PI3K/Akt信號通路失活有關。

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Effect of miR-21 on migration and invasion ability in human laryngeal squamous carcinoma cell Hep2

LiuYongjun1，GuanYanfei1,ChangShun2△

(1.DepartmentofEarNoseThroat;2.DepartmentofNeurosurgery,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650032,China)

ObjectiveTo explore the effect of microRNA-21(miR-21) on the migration and invasion ability in human laryngeal squamous carcinoma cell Hep2.MethodsThe MTT method was used to detect the viability of Hep2 cells at 48 h after miR-21 inhibitor and miR-21 NC transferring into Hep2 cells by LipofectamineTM2000.The cell migration ability was detected by using the scratch test.The cell invasion ability was detected by using the Transwell method.The activation of phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN)/ phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) / protein kinase B(Akt) signal pathway and the expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP2),MMP9,reversion inducing cysteine rich protein with kazal motif (RECK) was detected by using the Western blotting.ResultsCompared with miR-21 NC,miR-21 inhibitor could significantly reduce the Hep2 cell viability[(0.688±0.043)vs.(0.375±0.012)],inhibited the migration ability[(6.57±0.02)μmvs.(20.49±2.18) μm] and invasion ability[(100.7±10.2)vs.(46.8±4.3)],and the differences were statistically significant(P<0.01),meanwhile miR-21 inhibitor could down-regulate the expression of PI3K,MMP2 and MMP9(P<0.01),and reduced the phosphorylation level of Akt (P<0.01),up-regulated the expression of PTEN and RECK (P<0.01).ConclusionmiR-21 inhibitor can significantly suppress the migration and invasion ability of Hep2,which may be related with the PTEN/PI3K/Akt signal pathway.

microRNA-21；human laryngeal squamous carcinoma cell Hep2；migration；invasion

劉永軍(1983-)，住院醫師，碩士，主要從事耳鼻喉頭頸外科相關研究。△

，E-mail：stone1983712@163.com。

R739.65

A

1671-8348(2016)21-2906-03

2016-01-08

2016-03-26)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.008