Gli抑制劑GANT61對肺癌細胞上皮-間質轉化作用的研究

王　雷，杜媛鯤，王　娜

(1.河北醫科大學第四醫院胸二科，石家莊 050011；2.河北醫科大學期刊社，石家莊 050017；3.河北醫科大學第四醫院河北省腫瘤研究所分子生物室，石家莊 050011)

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Gli抑制劑GANT61對肺癌細胞上皮-間質轉化作用的研究

王雷1，杜媛鯤2，王娜3

(1.河北醫科大學第四醫院胸二科，石家莊 050011；2.河北醫科大學期刊社，石家莊 050017；3.河北醫科大學第四醫院河北省腫瘤研究所分子生物室，石家莊 050011)

目的研究GANT61對人肺癌細胞H1703和A549的上皮-間質轉化(EMT)的影響，并初步探討其作用機制。方法以二甲基亞砜(DMSO)作為對照(DMSO組)，用GANT61處理H1703和A549細胞24 h后，采用實時熒光定量PCR法檢測Gli-1、Gli-2、E-cadherin和Vimentin基因變化；蛋白質印跡法(Western blotting)觀察GANT61作用于H1703和A549細胞后對E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響，劃痕愈合實驗觀察GANT61作用于H1703和A549細胞后對腫瘤細胞侵襲能力的影響。結果與DMSO組比較，實時熒光定量PCR結果顯示GANT61可下調H1703和A549細胞Gli-1、Gli-2及Vimentin mRNA的表達，升高E-cadherin mRNA的表達(P<0.01)；Western blotting顯示，GANT61可以下調H1703和A549細胞Vimentin蛋白表達，升高E-cadherin蛋白表達(P<0.01)；劃痕愈合實驗顯示，GANT61處理組H1703和A549細胞的侵襲能力明顯下降(P<0.01)。結論肺癌的EMT與Hedgehog信號轉導通路中Gli-1和Gli-2的異常激活有關，GANT61通過下調Gli-1和Gli-2的表達影響肺癌細胞的EMT能力，Gli可能成為抑制肺癌細胞轉移的新的分子靶點。

肺癌；Hedgehog信號通路；GANT61；Gli蛋白；上皮-間質轉化

每年全球肺癌發病率和病死率高居各種惡性腫瘤之首，肺癌是我國增長速度最快的惡性腫瘤之一。肺癌病理學分型主要為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中鱗癌和腺癌為最常見的非小細胞肺癌類型，患者確診時多為中晚期，傳統放療、化療效果欠佳。近年來如酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)等靶向治療已經使部分腺癌患者受益，但多數非小細胞肺癌患者仍然沒有找到更合適的治療靶點。近年來研究發現，異常活化Hedgehog(Hh)信號通路在多種腫瘤的發生、發展中起著關鍵作用[1-5]。經典的Hh信號傳導通路主要包括Hh配體、Patched受體、Smoothened蛋白、核轉錄因子Gli及下游目的基因[6]。GANT61是近年研制的特異性針對Gli靶點的Hh通路抑制劑，具有較好的抗腫瘤活性。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，這種過程使上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力，并且與腫瘤的復發和轉移密切相關[7]。目前，關于Hh通路與肺癌EMT關系的研究較少，本研究通過探討GANT61特異性阻斷人肺癌細胞系H1703和A549中Gli-1和Gli-2的表達，觀察其對肺癌細胞EMT的影響，初步探討Hh通路與肺癌EMT的關系，以及GANT61的作用機制，為肺癌靶向治療提供新思路。

1　材料與方法

1.1細胞來源人肺鱗癌細胞系H1703和腺癌細胞系A549，由河北醫科大學第四醫院河北省腫瘤研究所分子生物室提供。

1.2儀器與試劑GANT61(美國Selleckchem公司)，Gli-1引物和探針(Hs00171790，美國Life technologies公司)，Gli-2引物和探針(Hs01119974_m1，美國Life technologies公司)，E- cadherin 引物和探針(Hs01023894_m1，美國Life technologies公司)，Vimentin引物和探針(Hs00257977_m1，美國Life technologies公司)，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物和探針(Hs02758991_g1，美國Life technologies公司)，上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)鼠抗人單克隆抗體(ab1416，美國Abcam公司)，波形蛋白(Vimentin)兔抗人單克隆抗體(ab92547，美國Abcam公司)，GAPDH鼠抗人單克隆抗體(sc32233，美國Santa Cruz公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒(美國Thermo Scientific公司)，M-PER培養細胞總蛋白提取試劑(美國Thermo Scientific公司)，蛋白酶抑制劑(德國roche公司)，cDNA合成試劑盒(美國Bio-Rad公司)，總RNA提取試劑盒(德國 Qiagen公司)，Taqman 基因表達預混液(美國應用生物系統公司)，Mini-PROTEAN TGX 預制膠(美國Bio-Rad公司)，Tris/甘氨酸/電泳緩沖液(美國Bio-Rad公司)，Tris/甘氨酸緩沖液(美國Bio-Rad公司)，SuperSignal West Femto最高靈敏度底物(美國Thermo-Pierce公司)。NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，Veriti?96-Well Thermal Cycler(美國應用生物系統公司)，ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養將人肺癌細胞系H1703和A549細胞培養于RPMI-1640培養液、10%胎牛血清、青鏈霉素各100 U/mL的培養基中，37 ℃ 5%CO2培養箱中孵育，取對數生長期細胞計數后接種到6孔和12孔板進行實驗。

1.3.2實時熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR)法于12孔板內呈70%～80%融合生長的H1703和A549細胞中加入濃度為10 μmol/L的GANT61，并同時更換無血清培養基，繼續處理24 h，對照組為二甲基亞砜(DMSO)組。(1)24 h后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，按照總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，每孔加總RNA提取試劑盒中提供的裂解緩沖液RLT 350 μL和70%無水乙醇350 μL；接著將裂解液上樣到帶有RNeasy硅膠膜的柱子中，12 000 r/min離心15 s后倒掉廢液，加入去蛋白液RW1 700 μL 12 000 r/min離心15 s倒掉廢液，再加入緩沖液RPE 500 μL有效洗滌去除其他各種污染物。最后將濃縮的純RNA洗脫到無RNA酶的水中。(2)將經RNeasy技術純化得到的RNA在NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計儀器中檢測RNA濃度，采用美國Bio-Rad公司的反轉錄cDNA合成試劑盒(iScript cDNA Synthesis Kit)和Veriti?96-Well Thermal Cycler儀器進行cDNA的反轉錄，方法參照試劑盒說明書，反轉錄條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min。(3)將cDNA稀釋10倍后加 cDNA、Taqman基因表達預混液，以及Gli-1、Gli-2、E-cadherin、Vimentin和GAPDH引物和探針到384孔板進行實時熒光定量PCR檢測，反應體系每孔10 μL(cDNA 4.5 μL，引物和探針0.5 μL，Taqman基因表達預混液5 μL)，PCR反應條件為95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共40個循環。讀取Ct值后采用2-△△Ct法進行數據分析。

1.3.3蛋白質印跡法(Western blotting)設對照組為DMSO，于6孔板內呈對數生長期的H1703和A549細胞加濃度為10 μmol/L的GANT61，并同時更換無血清培養基處理24 h，用PBS洗滌細胞后加細胞蛋白提取液和蛋白酶抑制劑，收集提取液后用BCA法測定蛋白濃度。于Mini-PROTEAN TGX預制膠中行蛋白上樣，每泳道上樣10 μg蛋白，在電泳槽中經Tris/甘氨酸/電泳緩沖液十二烷基硫酸鈉(SDS)進行電泳后在Tris-甘氨酸緩沖液中將蛋白電轉移印跡到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，再用5%脫脂奶粉/含吐溫20的Tris緩沖液(TBST)封閉PVDF膜1 h，E-cadherin工作濃度為1∶5 000、Vimentin工作濃度為1∶10 000，GAPDH工作液濃度為1∶10 000，4 ℃過夜，二抗工作濃度為1∶20 000孵育1 h后用TBST洗膜，再用SuperSignal West Femto最高靈敏度底物試劑發光后于暗室曝光顯影。

1.3.4劃痕愈合實驗取對數生長期細胞接種于6孔板，置37 ℃細胞培養箱中過夜。第2天培養至細胞呈70%～80%融合時加入濃度為10 μmol/L的GANT61處理 24 h，對照組為DMSO組，分別在GANT61處理組和對照組的單細胞層上劃痕，繼續培養以使劃痕愈合。于劃痕后24 h每組取4個視野拍照，在倒置顯微鏡下觀察細胞的劃痕愈合能力，用愈合率代表愈合能力。閉合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.4統計學處理應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1實時熒光定量PCR檢測結果檢測GANT61作用24 h對H1703和A549細胞Gli-1、Gli-2、E-cadherin及Vimentin基因的影響，結果表明：H1703細胞株中GANT61處理組Gli-1、Gli-2和Vimentin mRNA的表達水平低于對照組，E-cadherin mRNA表達水平較對照組上調，差異均有統計學意義(P值分別為0.003、0.001、0.004、0.001)；經GANT61處理的A549細胞Gli-1、Gli-2和Vimentin mRNA的表達水平低于對照組，E-cadherin mRNA的表達水平較對照組上調，差異均有統計學意義(P值分別為0.009、0.002、0.001、0.000)，見圖1。

A、C：H1703細胞；B、D：A549細胞。*：P<0.01，與DMSO組比較。

圖1實時熒光定量PCR檢測結果

2.2Western blotting檢測結果應用GANT61處理H1703后，E-cadherin蛋白表達高于對照組，Vimentin表達低于對照組，而內參GAPDH蛋白表達無明顯變化；A549細胞處理組E-cadherin蛋白表達高于對照組，而Vimentin蛋白表達低于對照組，內參GAPDH蛋白表達無明顯變化，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖2、3。

*：P<0.01，與DMSO組比較。

圖2Western bloting檢測結果

2.3劃痕愈合試驗GANT61處理18 h后，H1703的侵襲能力明顯受到抑制，閉合率為DMSO組的72%,與DMSO組相比，差異有統計學意義(P=0.000)。A549細胞GANT61處理組閉合率僅為DMSO組的45.4%，與DMSO組相比，差異有統計學意義(P=0.000)。見圖4。

*：P<0.01，與DMSO組比較。

圖3Western blottting檢測結果

*：P<0.01，與DMSO組比較。

圖4劃痕愈合實驗

3　討　　論

經典的Hh通路包括兩部分：(1)活化的Hh信號從質膜到胞內的過程,該過程涉及Smo的調控；(2)信號從胞內到核內的過程，該過程涉及轉錄因子家族Gli的調控。Gli蛋白家族包括3種形式：Gli-1、Gli-2和Gli-3。Gli-3被認為是轉錄抑制因子。Gli-1上調是Hh通路激活的重要標志，Gli-2是Hh信號調節的主要轉錄激活子，Gli-1和Gli-2在活化的Hh通路中起到承上啟下的核心作用，可以促進靶基因的異常表達，從而造成細胞過度增殖并最終癌變和轉移。Li等[8]在對間皮瘤的研究中發現，Gli靶點的抑制劑比針對Smo靶點的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，以及小分子藥物維莫德吉(vismodegib)、環巴胺(cyclopamine)等具有更好的抗腫瘤效應，以Gli-1和Gli-2為靶點對Hh信號通路進行調控可以起到精確高效的作用。因此，本研究選擇Gli特異性抑制劑GANT61進行抗腫瘤研究，結果顯示GANT61可以明顯下調H1703和A549細胞Gli-1、Gli-2基因的表達，表明肺癌細胞中存在Gli的異常激活，GANT61可以明顯抑制Gli的表達。

EMT是近年來抗腫瘤領域的研究熱點之一，EMT可以參與腫瘤的發生、發展，與腫瘤的侵襲轉移及耐藥等惡性生物學行為密切相關，其中E-cadherin是EMT特異性標記物之一，其表達水平降低可導致腫瘤細胞間黏附能力減低，遷移能力增強，從而導致腫瘤轉移[9]。Vimentin是間質細胞的重要標記物之一，可使細胞黏著斑的空間結構發生改變而影響腫瘤細胞的黏附與遷移能力，抑制Vimentin的表達可以減弱腫瘤細胞黏附、遷移能力[10]。本研究顯示，應用GANT61處理肺癌細胞24 h后可以下調Vimentin mRNA和蛋白表達，上調E-cadherin mRNA和蛋白表達。分析其原因可能是Gli-1和Gli-2作為Hh信號調節的主要轉錄激活子，可將異常激活的Hh/Gli信號傳導至細胞核內對多種靶基因起轉錄激活作用。因為EMT的發生涉及多種信號轉導通路參與其中，與誘導因子、轉錄因子及微環境等因素有關。有研究顯示，轉錄因子Gli可以通過調控EMT促進癌細胞的侵襲轉移[11-12]。本研究表明，GANT61可以通過靶向性抑制Gli-1和Gli-2的表達來上調E-cadherin，下調Vimentin，從而最終調控肺癌細胞的EMT進程。本研究的劃痕實驗也進一步證實了GANT61處理組腫瘤細胞的侵襲能力可以明顯下降。

綜上所述，由于過度活化的Hh信號通路在肺癌生長轉移中起著關鍵作用，以及Gli在Hh信號傳導通路中的核心作用，針對Gli靶點的治療可能成為肺癌治療的新策略之一。

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Study on role of GANT-61 as Gli inhibitor on epithelial-mesenchymal transition of lung cancer

WangLei1，DuYuankun2，WangNa3

(1.SecondDepartmentofThoracicSurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050011,China；2.JournalPress,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050017,China；3.DivisionofMolecularBiology,HebeiProvincialCancerInstitute,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050011,China)

ObjectiveTo research the effect of GANT61 on epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human lung cancer H1703 and A549 cells lines,and to preliminarily investigate its action mechanism．MethodsDMSO was used as the control(DMSO group).After treating H1703 and A549 cells with GANT61 for 24 h,the gene changes of Gli-1,Gli-2,E-cadherin and Vimentin were detected by using the real time fluorescence quantitative PCR method.The influence of GANT61 on the expression of E-cadherin and Vimentin protein after acting on H1703 and A549 cells was observed by using the Western blotting assay.The scratch healing test was performed to evaluate the effect of GANT61 on the tumor cell invasion ability after acting on H1703 and A549 cells.ResultsThe real time fluorescence quantitative PCR showed that,compared with the DMSO group,GANT61 down-regulated the mRNA expression of Gli-1,Gli-2 and Vimentin mRNA of H1703 and A549 cell lines and elevated the expression of E-cadherin protein(P<0.01);the Western blotting showed that GANT61 down-regulated the expression of Vimentin of H1703 and A549 cell lines, and elevated the expression of E-cadherin(P<0.01)；the scratch healing test revealed the invasion ability of H1703 and A549 cells in the GANT61 treatment group was significantly decreased (P<0.01).ConclusionEMT in lung cancer is related with aberrant activations of Gli1 and Gli2 in Hedgehog signal transduction pathway,GANT61 could influence the EMT ability in lung cancer cells by down-regulating the expression of Gli-1 and Gli-2.Gli could become a new molecular target for inhibiting the lung cancer cell metastasis

lung cancer; Hedgehog signaling pathway; GANT61; Gli protein; epithelial-mesenchymal transition

王雷(1976-)，副教授，博士后，主要從事胸部腫瘤的靶向治療研究。

R734.2

A

1671-8348(2016)21-2903-03

2016-01-23

2016-04-10)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.007