3-甲基腺嘌呤對急進高原缺氧大鼠腸上皮細胞損傷的自噬影響研究

鄭曉鳳，張久聰，鄧尚新，王彬彬，周慧茹，楊永林，馬　強，張方信*

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3-甲基腺嘌呤對急進高原缺氧大鼠腸上皮細胞損傷的自噬影響研究

鄭曉鳳1,2，張久聰2，鄧尚新2，王彬彬2，周慧茹2，楊永林2，馬強2，張方信2*

1.蘭州大學第二醫院消化科，蘭州 730030；2.蘭州軍區蘭州總醫院消化科，蘭州 730050

[摘要]目的探討自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)對急進高原缺氧大鼠腸上皮細胞自噬水平及損傷程度的影響。方法將50只Wistar大鼠隨機分成5組(A～E組),在低氧氧艙環境下建立急進高原缺氧大鼠腸上皮細胞損傷模型，用3-MA進行處理，肉眼觀察各組大鼠的行為學改變，HE染色分析大鼠腸組織的損傷程度，免疫組織化學檢測自噬相關蛋白LC-3、Beclin-1的表達情況，RT-PCR方法檢測LC-3、Beclin-1 mRNA的表達情況。結果3-MA作用于缺氧大鼠腸上皮細胞后，腸組織的病理性損傷明顯加重，自噬相關蛋白LC-3、Beclin-1及其相關mRNA表達也顯著降低,細胞自噬水平下降。結論3-MA可能通過降低細胞自噬水平加重急進高原缺氧腸上皮細胞損傷，細胞自噬可能是急進高原缺氧腸上皮細胞損傷過程中的重要保護因素之一。

[關鍵詞]3-甲基腺嘌呤；腸上皮細胞損傷；自噬；高原；缺氧

0　引言

腸上皮細胞對缺氧反應敏感，易引起一定的損傷。最近的研究發現，急進高原缺氧環境促進腸上皮細胞損傷，且與自噬活性的表達有關[1]。自噬與腫瘤細胞缺氧的關系已得到國內外研究的證實，但具體是一種保護作用還是抑制作用仍存有爭議，目前的研究多認為自噬可保護腫瘤細胞增加對缺氧的耐受[2]，然而自噬在高原環境引起的缺氧應激腸上皮細胞損傷中是否也是一種保護機制尚不明確。本實驗通過建立大鼠急進高原缺氧模型，應用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)干預自噬的表達，初步探討細胞自噬在急進高原缺氧引起的腸上皮細胞損傷中的作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物和分組選擇50只SPF級雄性Wistar大鼠(蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗中心提供)，大鼠體重180～280 g，6～9周齡。將大鼠隨機平均分為A、B、C、D、E 5組，A組為平原對照組，B組為急進高原缺氧24 h組，C組為急進高原缺氧24 h(3-MA)干預組，D組為急進高原缺氧48 h組，E組為急進高原缺氧48 h(3-MA)干預組。利用模擬高原低壓氧艙建立急進高原缺氧大鼠腸上皮細胞損傷模型，模型建立前0.5 h分別給予A～C組腹腔注射1 mL 0.9%生理鹽水，C組和E組腹腔注射3-MA(劑量為20 mg/kg，溶于1 mL生理鹽水中)。各組大鼠在模型建立后不同時間點斷頸處死后，打開腹腔，暴露十二指腸及空回腸，距十二指腸起始處15 cm處截取兩段2～5 cm長的空腸上段組織，用生理鹽水沖洗干凈，一段立即放入4%甲醛固定液中，一段放入凍存管中-80 ℃冰箱中保存，待檢測相關指標。

1.2主要試劑LC3A/B(兔多克隆)抗體，Beclin-1(小鼠單克隆)抗體均購自美國Abcam公司；3-Methyladenine購自Sigma公司，LC3、Beclin-l及β-actin引物序列由Takara公司合成，用于RT-PCR的RNAiso plus、逆轉錄試劑盒及SYBR熒光定量PCR試劑盒均購自Takara公司，即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋試劑公司，水合氯醛、4%多聚甲醛、PBS緩沖液均由蘭州軍區蘭州總醫院實驗科提供。

1.3檢測指標和方法

1.3.1大鼠行為學及腸道組織病理學觀察肉眼分別觀察給予缺氧處理及應用3-MA后大鼠精神、呼吸、動作等的變化，處死大鼠后，在空腸上段取材，制成切片，經過HE染色，在電子顯微鏡下觀察每組大鼠腸道組織的病理損傷情況，按Chiu氏病理評分進行統計學分析，具體評分標準參照表1。

表1　腸黏膜Chiu氏病理評分標準

1.3.2免疫組織化學方法檢測自噬相關蛋白LC-3、Beclin-1采用SABC方法進行免疫組織化學反應，小鼠單克隆Beclin-1抗體按1∶50稀釋，兔多克隆LC3抗體按1∶100稀釋，將浸泡在多聚甲醛中的腸組織取出裁剪，固定，制成厚度為4 μm的切片，然后依次經過烤箱烘烤-脫蠟脫水-檸檬酸高壓熱修復-雙氧水-加入BSA-加稀釋后一抗-加入二抗-SABC-DAB顯色-蘇木素復染-鹽酸、氨水酒精分化-脫水-封片等處理。由兩位病理醫生在光鏡高倍鏡下(×200)隨機選取5個不同視野觀察分析并拍照，腸上皮細胞質或細胞核中顆粒顏色為棕黃色為陽性表達，通過Image-Pro-Plus分析軟件對圖像進行分析，陽性細胞目的蛋白的表達用平均光密度值(MOD值)表示。

1.3.3RT-PCR方法檢測自噬相關基因的表達從GenBank中查找LC3、Beclin-1基因序列，基因的設計及合成由Takara試劑公司完成，最后經BLAST檢測合成的引物序列證實為特異性引物序列(見表2)。將保存在-80 ℃冰箱中的腸組織取出，稱取50～100 g，采用Trizol試劑盒提取腸組織總RNA，用分光光度計對所提取的RNA進行檢測，算出OD260/OD280，范圍在1.8～2.0之間即可繼續進行下面的操作，所提的總RNA可于-70 ℃冰箱中保存；也可直接將RNA反轉錄為cDNA，反應條件為37 ℃ 15 min-85 ℃ 5 s-4 ℃，合成的cDNA于-20 ℃冰箱內保存；PCR擴增反應，將合成的引物稀釋備用，采取SYBRGreen Ⅰ嵌合熒光法，配成20 μL反應體系，進行RT-PCR反應，每個樣本每個基因重復3次，在擴增儀上進行擴增反應為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，共40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s下溶解；分析整理實驗結果，確保擴增曲線標注擴增完成，擴增產物融解曲線為單峰曲線，特異性好，用2-△△Ct法分析待測基因的相對表達量，△Ct=目的基因Ct值-β-actin Ct值。△△Ct=實驗組目的基因△Ct-對照組目的基因△Ct。

表2　RT-PCR引物序列及大小

2　結果

2.1行為學及組織病理學觀察當開始暴露于缺氧環境時，大鼠起先暴躁不安，接著雙眼迷離，呼吸急促，自主活動量減少，逐漸脫離缺氧環境，大鼠開始暴躁活躍、自主活動明顯增多，給予3-MA的大鼠反應更加敏感激烈。

肉眼觀察大鼠腸道組織，B～E組的小腸組織可見不同程度的節段性充血、壞死，且3-MA組比同一時間段的模型組充血更明顯。光鏡下觀察，與A組正常的腸黏膜組織相比，B～E組大鼠的腸黏膜均有不同程度的損傷，包括絨毛脫落、毛細血管充血、黏膜層跟黏膜下層的局部分離等，Chiu′s評分等級顯著升高(P<0.05)，各用藥組(C組和E組)較模型組(B組和D組)損傷程度加重，局部可見固有層的暴露及炎性細胞的浸潤(P<0.01)。見圖1、表3。

表3　大鼠腸道病理損傷級別得分比較

注：*與A組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05；#與D組比較，P<0.01

圖1　組織病理學觀察

2.2免疫組織化學檢測每張切片隨機選取5個高倍視野(×200)進行圖像分析。結果表明，LC3、Beclin-1在正常腸上皮細胞中表達極少(圖2A、圖3A)，而在高原缺氧各個時間點的細胞中有顯著陽性表達，胞質成棕黃色或褐黃色，偶有細胞核中表達(圖2B、D，圖3B、D)，兩者比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與不同時間點模型組比較，3-MA組LC3、Beclin-1陽性表達下降(圖2C、E，圖3C、E)，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

2.3RT-PCR結果相對于A組，B組、D組的Beclin-1 mRNA的相對表達量分別為8.85±0.28、4.29±0.16，表達顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，與B組比較，C組Beclin-1 mRNA相對表達量為1.76±0.19，明顯降低(P<0.05)。與D組比較，E組Beclin-1 mRNA相對表達量為2.16±0.13，表達顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)，LC3 mRNA表達同上(見表5)。

表4　各組LC3及Beclin-1表達情況

注：*與A比較，P<0.05;△與B組比較，P<0.05;#與D組比較，P<0.05

表5　各組LC3 mRNA及Beclin-1 mRNA表達情況(2-△△Ct值)

注：*與A組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05；#與D組比較，P<0.05

圖2　各組LC3表達情況

3　討論

高原缺氧條件下，機體各器官均表現出不同程度的缺氧應激反應，腸道作為一個對缺氧比較敏感的器官之一，消化道癥狀亦不少見。李素芝等[3]對我國1 753例急進高原地區的普通人群研究發現，約62.58%的個體出現消化道反應，其癥狀發生率由高到低依次為腹脹、食欲不振、惡心、嘔吐、腹痛等。張久聰等[4]對1 137例駐格爾木高原官兵急進高原胃腸道應激反應進行調查研究發現，進駐不同海拔高度高原3 d內消化系統癥狀依次表現為納差(54.7%)、惡心(31.1%)、腹脹(25.1%)、腹瀉(23.3%)、便秘(18.3%)。綜合分析高原消化道反應發生的原因可能由于：高原缺氧應激引起胃腸道黏膜屏障功能損傷，腔內致病菌及內毒素移位，誘導炎癥介質的釋放、活化，嚴重者可誘發全身炎癥反應綜合征(SIRS)；另一方面，缺氧環境引起機體氧供不足，大腦缺氧導致中樞神經系統調節能力減弱，進而影響胃腸道消化液的分泌功能[4-6]。近年研究發現，缺氧應激使胃腸功能下降，且組成腸黏膜屏障的上皮細胞中存在細胞自噬現象[7]，我們前期的實驗也發現與之相符的結果。

細胞自噬是除凋亡、壞死之外的另一種細胞程序性死亡，在正常情況下，面對各種外界刺激如缺氧、饑餓、紫外線照射時，細胞自噬常作為一種保護機制而存在，通過利用自身的溶酶體清除大分子物質和受損的細胞器，促進機體對外界不良環境的適應[8]。但是在過度應激條件下，細胞自噬的發生則導致細胞的程序性死亡。已經有研究發現，在多種腫瘤細胞中，缺氧可誘導自噬的發生，但是在高原缺氧環境下，腸上皮細胞是否有自噬的發生，且對機體是何種作用，尚是一個新的研究領域，需要進一步研究。

通過我們前期的研究已經發現[1,4,6,9]，高原缺氧環境引起腸黏膜屏障的損傷，且自噬體和自噬相關蛋白LC3、Beclin-1表達增加，提示細胞自噬現象的發生明顯增強，且隨著時間的延長，黏膜屏障損傷加重，腸上皮細胞自噬發生明顯增多，鑒于之前的研究結果，推測細胞自噬可能對高原缺氧引起的腸粘膜屏障損傷起保護作用。本研究是在前期研究的基礎上，篩選出細胞自噬現象發生較明顯的時間點(24、48 h)，在高原缺氧腸應激模型中應用自噬抑制劑3-MA干預腸上皮細胞自噬的發生，進一步探討細胞自噬發生的強弱及腸上皮細胞的損傷程度。自噬抑制劑3-MA是至今應用范圍廣泛且比較成熟的藥物之一，且有關研究表明，面對饑餓等應激，3-MA可通過抑制心肌細胞自噬作用，促進凋亡的發生，引起心肌細胞的死亡[10]，另外，3-MA也能通過抑制細胞自噬，增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用[11-12]。其發揮作用的機制可能是由于3-MA主要阻滯Ⅲ類磷脂酰肌醇3磷酸激酶(class Ⅲ PI3K)，從而影響自噬相關蛋白到自噬小體膜聚集啟動自噬的發生來實現的[13]。我們通過有關文獻及前期的預實驗篩選出3-MA發揮抑制自噬作用的最佳濃度，在不同的海拔條件下證明3-MA對腸黏膜上皮細胞的作用，進而得出結論。通過肉眼觀察及腸道HE染色結果表明，應用3-MA后，腸上皮細胞炎性水腫、壞死等損傷加重，初步提示細胞自噬對高原缺氧上皮細胞可能是一種保護作用。

雖然到目前為止，在真核生物體內已經發現了幾十種自噬相關蛋白及同源物，但LC3、Beclin-1在自噬發生的不同階段具有各自的作用，常作為自噬體發生的標志蛋白。其中，LC3微管相關蛋白1-輕鏈3(Microtubule-associated protein 1-light chain 3,LC-3)，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種，在自噬發生時，LC3-Ⅱ與自噬膜結合，其含量的高低可反映自噬泡的多少[14]。另外，LC3按亞型可分為3種，即LC3A、LC3B、LC3C，其中LC3B可用于特異性檢測自噬活性，因此，本實驗采用LC3B-Ⅱ抗體，電子顯微鏡下觀察其在腸上皮細胞中的特異性表達情況。Beclin-1基因由Liang等[15]在研究大鼠抵抗Sindbis病毒感染中樞神經系統的機制時首次發現，是首個也是唯一一個可啟動自噬發生的基因，其發揮作用的方式主要通過與Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)結合，啟動PI3K/Akt(PKB)通路，聚集其他自噬相關蛋白到自噬前體定位，來促進自噬的發生[16]。本實驗通過免疫組織化學法分別于24、48 h時間點檢測模型組及3-MA組LC3、Beclin-1等自噬相關蛋白表達，結果顯示，模型組大鼠腸上皮細胞質中棕黃色顆粒明顯增多，而3-MA組陽性顆粒明顯減少，提示LC3、Beclin-1等蛋白表達量下降。另外，RT-PCR檢測結果顯示，模型組自噬相關基因表達明顯上調，3-MA組基因表達則明顯下降，與免疫組織化學結果相對應。最近有研究表明，自噬對缺氧環境中腫瘤細胞既有保護作用，也有自噬性死亡的殺傷作用[17-18]。推測在高原缺氧應激條件下，自噬可能起保護作用，與最初的猜想結果是一致的。

綜上所述，高原缺氧條件下，應用3-MA后腸上皮細胞損傷明顯，自噬活性下調，細胞自噬對腸上皮細胞可能是一種保護作用，但其具體的作用機制有待進一步研究，為高原相關胃腸道不適的預防及治療提供了一個新思路。

參考文獻：

[1]Zhang F,Deng Z,Li W,et al.Activation of autophagy in rats with plateau stress-induced intestinal failure[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(2):1816-1821.

[2]Burada F,Nicoli ER,Ciurea ME,et al.Autophagy in colorectal cancer:an important switch from physiology to pathology[J].World J Gastrointest Oncol,2015,7(11):271-284.

[3]李素芝，鄭必海，閆春城，等.急進高原個體胃腸型高原反應發生情況及其原因[J].職業與健康,2011,27(4)：427-429.

[4]張久聰，楊永林，馬香芝，等.駐格爾木高原官兵急進高原胃腸道應激反應調查研究[J].西北國防醫學雜志，2015,36(8)：27-29.

[5]Pastorelli L,De Salvo C,Mercado JR,et al.Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation:lessons learned from animal models and human genetics[J].Front Immunol,2013,4:280.

[6]張久聰，耿聞男，張方信，等.不同海拔高度官兵519例胃鏡臨床分析[J].西北國防醫學雜志，2016,37(1)：38-41.

[7]Henderson PW,Weinstein AL,Sung J,et al.Hydrogen sulfide attenuates ischemia-reperfusion injury in in vitro and in vivo models of intestine free tissue transfer[J].Plast Reconstr Surg,2010,125(6):1670-1678.

[8]Li J,Yang D,Wang W,et al.Inhibition of autophagy by 3-MA enhances IL-24-induced apoptosis in human oral squamous cell carcinoma cells[J].J Exp Clin Cancer Res,2015,34:97.

[9]Zhang F,Wu W,Deng Z,et al.High altitude increases the expression of hypoxia-inducible factor 1α and inducible nitric oxide synthase with intest-inal mucosal barrier failure in rats[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(5):5189-5195.

[10]楊翼，李章華，賀磊磊，等.自噬抑制劑3-MA對“饑餓狀態”下心肌細胞自噬和凋亡的影響[J].武漢體育學院學報,2014,48(11)：61-66.

[11]Liu D,Yang Y,Liu Q,et al.Inhibition of autophagy by 3-MA potentiates cisplatin-induced apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cells[J].Med Oncol,2011,28(1):105-111.

[12]Li J,Hou N,Faried A,et al.Inhibition of autophagy by 3-MA enhances the effect of 5-FU-induced apoptosis in colon cancer cells[J].Ann Surg Oncol,2009,16(3):761-771.

[13]Wu YT,Tan HL,Shui G,et al.Dual role of 3-methyladenine in modulation of autophagy via different temporal patterns of inhibition on class I and III phosphoinositide 3-kinase [J].J Biol Chem,2010,285(14):10850-10861.

[14]Hu YF,Lei X,Zhang HY,et al.Expressions and clinical significance of autophagy-related markers Beclin1,LC3,and EGFR in human cervical squamous cell carcinoma[J].Onco Targets Ther,2015,8:2243-2249.

[15]Liang XH,Kleeman LK,Jiang HH,et al.Protection against fatal Sindbis virus encephalitis by beclin,a novel Bcl-2-interacting protein[J].J Virol,1998,72(11):8586-8596.

[16]Zhao R,Chen M,Jiang Z,et al.Platycodin-D induced autophagy in non-small cell lung cancer cells via PI3K/Akt/mTOR and MAPK signaling pathways[J].J Cancer,2015,6(7):623-631.

[17]Sakitani K,Hirata Y,Hikiba Y,et al.Inhibition of autophagy exerts anti-colon cancer effects via apoptosis induced by p53 activation and ER stress[J].BMC Cancer,2015,15:795.

[18]Qin W,Li C,Zheng W,et al.Inhibition of autophagy promotes metastasis and glycolysis by inducing ROS in gastric cancer cells[J].Oncotarget,2015,6(37):39839-39854.

收稿日期：2016-01-29

基金項目：國家自然科學基金(81570481)；甘肅省自然科學基金(145RJZA049)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607002

Study on the influence of 3-Methyladenine on autophagy in intestinal epithelial cells of hypoxic rats rapidly ascending to high altitude areas

ZHENG Xiao-feng1,2,ZHANG Jiu-cong2,DENG Shang-xin2,WANG Bin-bin2,ZHOU Hui-ru2,YANG Yong-lin2,MA Qiang2,ZHANG Fang-xin2*

(1.Department of Gastroenterology,the Second Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730030,China;2.Department of Gastroenterology,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command,Lanzhou 730050,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the influence of autophagy inhibitor 3-Methyladenine (3-MA) on the level of autophagy and the injury extent of intestinal epithelial cells caused by hypobaric hypoxia in rats rapidly ascending to high altitude areas.MethodsFifty healthy male Wistar rats were randomly divided into 5 groups (A to E) and intestinal epithelial cell injury in the models of rats with hypobaric hypoxia were established in decompression chamber.Autophagy inhibitor 3-MA was employed for drug intervention.Behavioral change of rats was observed,the intestinal tissue injury was analyzed by HE staining,and the expressions of autophagy-related protein LC-3 and Beclin-1 were detected by immunohistochemistry,and the mRNA expressions of LC-3 and Beclin-1 were quantified by RT-PCR.ResultsThe injury of intestinal tissue was significantly aggravated in 3-MA group,the expressions of autophagy-related protein LC-3 and Beclin-1 and corresponding mRNAs were also significantly lower in 3-MA group.Conclusion3-MA may aggravate the damage to intestinal epithelial cells by inhibiting the autophagy in hypoxic rats rapidly ascending to high altitude areas.Autophagy may play a pivotal role in the protection of intestinal epithelial cell in high altitude areas.

Key words：3-Methyladenine;Intestinal epithelial cells injury;Autophagy;High altitude;Hypoxia