移植物中CCR6+及CCR7+ T細(xì)胞數(shù)量與異基因造血干細(xì)胞移植受者急性移植物抗宿主病發(fā)生的關(guān)系*

王　萌，徐　衍，孫　慧，謝新生，馬　杰，甘思林，劉延方

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州 450052

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移植物中CCR6+及CCR7+T細(xì)胞數(shù)量與異基因造血干細(xì)胞移植受者急性移植物抗宿主病發(fā)生的關(guān)系*

王萌，徐衍，孫慧，謝新生，馬杰，甘思林，劉延方#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州 450052

摘要目的：探討移植物中表達(dá)趨化因子受體6(CCR6)或CCR7的T細(xì)胞數(shù)量與異基因造血干細(xì)胞移植后急性移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生的關(guān)系。方法：選取行親緣異基因造血干細(xì)胞移植的52對(duì)供受者為研究對(duì)象，經(jīng)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員后，測(cè)定并比較骨髓和外周血采集物中CCR6+或CCR7+T細(xì)胞的數(shù)量，分析輸注的各亞群T細(xì)胞數(shù)量與移植后受者發(fā)生Ⅱ-Ⅳ度急性GVHD的關(guān)系。 結(jié)果：動(dòng)員后，外周血采集物中CD4+CCR6+、CD8+CCR6+、CD4+CCR7+及CD8+CCR7+ T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量均較骨髓中增多(P<0.05)，是骨髓中的15～25倍，但移植物中上述各亞群細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量不是移植后受者發(fā)生急性GVHD的危險(xiǎn)因素(P>0.05)。結(jié)論：移植后受者急性GVHD的發(fā)生可能與移植物中CCR6+ 或CCR7+ T細(xì)胞的數(shù)量無(wú)關(guān)。

異基因造血干細(xì)胞移植(allogenetic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)已成為治愈惡性血液病的重要方法之一，而移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)是allo-HSCT后的重要并發(fā)癥，也是導(dǎo)致移植失敗、影響患者生存和預(yù)后的重要因素之一[1-2]。一般把移植后100 d以內(nèi)發(fā)生的GVHD稱為急性GVHD。急性GVHD是T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病，供者T細(xì)胞的激活和擴(kuò)增以及炎性細(xì)胞因子的大量釋放是造成急性GVHD的兩大主要因素。而趨化因子及其受體介導(dǎo)的T細(xì)胞的遷移是急性GVHD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已成為移植免疫研究的熱點(diǎn)。研究[3-4]表明，CCR6和CCR7與移植免疫密切相關(guān)，密切參與急性GVHD的發(fā)病機(jī)制。造血干細(xì)胞移植時(shí)移植物中CD4+CCR7+T細(xì)胞的比例已被證實(shí)可影響受者急性GVHD的發(fā)生[4-5]。該研究中作者比較了重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)動(dòng)員后骨髓采集物(G-BM)和外周血采集物(G-PB)中CCR6+或CCR7+T細(xì)胞的數(shù)量，并分析輸注的CCR6+及CCR7+T細(xì)胞數(shù)量和急性GVHD發(fā)生的關(guān)系，以進(jìn)一步探索急性GVHD發(fā)生的可能機(jī)制。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象回顧性分析2012年6月至2015年10月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行親緣allo-HSCT移植的病例52例，研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)檢測(cè)血白細(xì)胞及血小板達(dá)到植入標(biāo)準(zhǔn)，且移植100 d后經(jīng)熒光染色體原位雜交或DNA位點(diǎn)短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性等檢測(cè)證實(shí)供者細(xì)胞完全植入者。②移植后100 d內(nèi)仍存活且未復(fù)發(fā)者。52例移植受者中男18例，女34例，中位年齡36(2～59)歲，移植受者隨訪均超過(guò)100 d。從疾病診斷至移植的中位時(shí)間為135(78～386) d，疾病類型包括急性髓系白血病25例，急性淋巴細(xì)胞白血病14例，淋巴瘤7例，骨髓增生異常綜合征6例。所有病例均為骨髓+外周血造血干細(xì)胞移植。供受者HLA全相合22例，不全相合30例。移植時(shí)供者年齡中位數(shù)38(14～57)歲。

1.2預(yù)處理方案移植預(yù)處理采用改良Bu/Cy方案[移植前8～10 d靜脈輸注阿糖胞苷(Ara-C) 2 g/(m2·d)，移植前5～7 d口服白消安(Bu)4 mg/(kg·d)或靜脈輸注3.2 mg/(kg·d)，移植前3～4 d靜脈輸注環(huán)磷酰胺(Cy)1.8 g/(m2·d)]或改良Bu+Flu方案[移植前8～10 d靜脈輸注Ara-C 2 g/(m2·d)，移植前5～7 d 口服Bu 4 mg/(kg·d)或靜脈輸注3.2 mg/(kg·d)，移植前2～6 d靜脈輸注氟達(dá)拉濱(Flu)30 g/(m2·d)]。HLA不全相合親緣移植在預(yù)處理中均加用兔源ATG(總量10 mg/kg，分4次靜脈輸注)。

1.3急性GVHD的防治與診斷急性GVHD的常規(guī)預(yù)防采用環(huán)孢素A(CsA)+短程甲氨蝶呤(MTX)+霉酚酸酯(MMF)。CsA血藥濃度谷值維持在150～250 μg/L，預(yù)處理時(shí)開(kāi)始加用，移植3個(gè)月后逐漸減量；MMF 7.5 mg/kg，2次/d，預(yù)處理時(shí)開(kāi)始加用，移植后1個(gè)月停用；MTX 15 mg/m2(移植后第1 天)、10 mg/m2(移植后第3、5、11 天)。急性GVHD的診斷和分級(jí)參照文獻(xiàn)[6]。

1.4動(dòng)員方案和標(biāo)本的采集與測(cè)定所有供者皮下注射rhG-CSF[10 μg/(kg·d)]，連續(xù)5 d，在動(dòng)員第4天采集供者骨髓干細(xì)胞800 mL(采集過(guò)程中輸注自體血400 mL)，在動(dòng)員第5天行外周血干細(xì)胞單采。采集的骨髓及外周血干細(xì)胞均于采集后6 h內(nèi)回輸給受者。采集時(shí)常規(guī)留取骨髓血5 mL，外周血采集物1 mL。標(biāo)本留取后1 h內(nèi)應(yīng)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，并同時(shí)涂片兩張，在顯微鏡下分類計(jì)數(shù)，24 h內(nèi)進(jìn)行熒光抗體標(biāo)記及上機(jī)測(cè)定。標(biāo)本均標(biāo)記以下單抗：CD3-FITC、CD4-PerCP、CD8-PerCP、CCR6-PE(同型對(duì)照Mouse IgG1-PE)、CCR7-PE(同型對(duì)照Rat IgG2a-PE)，染色后經(jīng)PBS洗滌，最后予多聚甲醛固定，6 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD3+CD4+/CD3+CD8+T細(xì)胞亞群的比例，CD3+CD4+及CD3+CD8+T細(xì)胞表面CCR6和CCR7的表達(dá)，最后計(jì)算移植物中各亞群T細(xì)胞的數(shù)量。所用流式細(xì)胞儀及主要試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，T細(xì)胞數(shù)量均以中位數(shù)和上下四分位數(shù)描述，組間數(shù)據(jù)的比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，急性GVHD的累積發(fā)生率采用Kaplan-Meier方法計(jì)算，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1比較G-BM和G-PB中各亞群T細(xì)胞數(shù)量經(jīng)rhG-CSF動(dòng)員后，G-BM和G-PB中各亞群細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與G-BM相比，G-PB中各亞群T細(xì)胞數(shù)量較多。

2.2輸注不同亞群的T細(xì)胞數(shù)量與受者發(fā)生Ⅱ-Ⅳ度急性GVHD的關(guān)系52例移植受者隨訪至移植后100 d，累計(jì)發(fā)生Ⅱ度、Ⅲ度和Ⅳ度急性GVHD分別為12例(23.1%)、6例(11.5%)和2例(3.8%)，發(fā)生的中位時(shí)間為移植后35(11～90) d。輸注不同亞群的T細(xì)胞數(shù)量與移植后受者發(fā)生急性GVHD的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，輸注以下各亞群細(xì)胞的數(shù)量與受者急性GVHD的發(fā)生無(wú)關(guān)。

表1　G-BM和G-PB中各亞群T細(xì)胞數(shù)量比較(n=52)

表中數(shù)據(jù)為中位數(shù)(P25，P75)。

圖1　不同T細(xì)胞亞群(A→G)數(shù)量與移植后受者發(fā)生急性GVHD的關(guān)系

3討論

急性GVHD是allo-HSCT后重要的并發(fā)癥，CCR6及CCR7已被證實(shí)在急性GVHD的發(fā)生發(fā)展中極為重要。

CCR6是輔助性T(Th)17細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞比較特異的標(biāo)志[7]，而Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞均已被證實(shí)在GVHD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8-9]。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，在allo-HSCT后發(fā)生急性GVHD的患者體循環(huán)中CD161+CCR6+Th17細(xì)胞向GVHD靶器官遷移增多，CCL20(CCR6的配體)在靶器官的浸潤(rùn)增加。Varona等[3]的研究證實(shí)，CCR6可以促使活化的同種異體的反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞向GVHD靶器官募集，從而認(rèn)為CCR6能夠調(diào)控CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的急性GVHD反應(yīng)，在GVHD的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。 當(dāng)急性GVHD出現(xiàn)時(shí)，T細(xì)胞向次級(jí)淋巴器官(SLO)的遷移減少，向GVHD靶器官的遷移增多[11]。而CCR7主要表達(dá)在幼稚和中心記憶T細(xì)胞上，作用在于調(diào)控T細(xì)胞向SLO的歸巢和遷移。當(dāng)CCR7缺陷時(shí)，CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的遷移和功能受損[12-13]，從而可能致使受者發(fā)生急性GVHD的風(fēng)險(xiǎn)增高或GVHD的程度加重[8,14]。CCR7+間充質(zhì)干細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞已被證實(shí)能夠抑制急性GVHD的發(fā)生發(fā)展[15-16]。此外，CCR7缺陷亦可以損傷效應(yīng)記憶T細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致GVHD加重[17]。以上研究提示CCR6及CCR7密切參與移植后急性GVHD的發(fā)病機(jī)制。

Choufi[4]認(rèn)為輸注移植物中CD4+CCR7+細(xì)胞的相對(duì)比例超過(guò)76%時(shí)，容易發(fā)生急性GVHD。Waller等[5]證實(shí)當(dāng)輸注的骨髓細(xì)胞中包含較多幼稚T細(xì)胞(CCR7+T細(xì)胞)時(shí)，移植后急性GVHD的發(fā)生率明顯下降，雖然兩者結(jié)果不相一致，但提示輸注的CD4+CCR7+細(xì)胞比例能夠影響移植后急性GVHD的發(fā)生發(fā)展。該研究中，輸注CCD6+及CCR7+T細(xì)胞數(shù)量的增加并未引起急性GVHD的風(fēng)險(xiǎn)升高或者降低，因此可以推測(cè)受者急性GVHD的發(fā)生與輸注T細(xì)胞的數(shù)量無(wú)關(guān)，而可能與移植物中不同T細(xì)胞亞群的相對(duì)比例有關(guān)。

有研究[18-19]表明，與輸注未去T細(xì)胞的移植物相比，輸注去T細(xì)胞的移植物能顯著降低慢性GVHD的發(fā)生率，但對(duì)急性GVHD無(wú)顯著影響。該研究中，移植物中CD3+CD4+及CD3+CD8+T細(xì)胞的數(shù)量亦與移植后急性GVHD的發(fā)生無(wú)關(guān)，與上述研究相符。此外，該研究結(jié)果亦表明，G-PB中各亞群T細(xì)胞數(shù)量均顯著高于骨髓。盡管G-PB中T細(xì)胞數(shù)量高于G-BM數(shù)倍，但與骨髓移植相比，外周血造血干細(xì)胞移植后急性GVHD的發(fā)生率并未進(jìn)一步增高，支持輸注的T細(xì)胞數(shù)量不是移植后GVHD發(fā)生的影響因素的論述。

綜上所述，allo-HSCT后受者急性GVHD的發(fā)生與移植物中CCR6+及CCR7+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量無(wú)關(guān)，而可能與不同亞群T細(xì)胞的相對(duì)比例有關(guān)。

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(2015-12-22收稿責(zé)任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.015

#通信作者，男，1962年5月生，博士，教授，研究方向：惡性血液病的診治， E-mail:liuyf371@163.com

中圖分類號(hào)R733

關(guān)鍵詞急性移植物抗宿主病；CC趨化因子受體6；CC趨化因子受體7；異基因造血干細(xì)胞移植

Correlation of quantity of CCR6+and CCR7+T lymphocytes in grafts with occurrence of acute graft-versus-host disease in recipients after allo-HSCT

WANG Meng, XU Yan, SUN Hui, XIE Xinsheng, MA Jie, GAN Silin, LIU Yanfang

DepartmentofHematology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsacute graft-versus-host disease;C-C chemokine receptor type 6;C-C chemokine receptor type 7;allogenetic hematopoietic stem cell transplantation

AbstractAim: To detect the quantity of T cell subsets expressing C-C chemokine receptor type 6(CCR6) or CCR7 in the grafts and analyze their correlation with the occurrence of acute graft-versus-host disease(GVHD). Methods: Fifty-two pairs of healthy donor and their recipients with family donor allogenetic hematopoietic stem cell transplantation(allo-HSCT) were included in this study. All the recipients were injected recombinant human granulocyte colony-stimulating factor(rhG-CSF) for mobilizing. The quantity of T cells expressing CCR6 or CCR7 in rhG-CSF mobilized bone marrow grafts(G-BM) and peripheral blood grafts(G-PB) were detected and compared. The correlation of the quantity of each subset cells with the cumulative incidence of grades Ⅱ to Ⅳ acute GVHD in recipients was analyzed.Results: After rhG-CSF mobilization, G-PB had obviously more T cells than G-BM(P<0.05). CD4+CCR6+, CD8+CCR6+, CD4+CCR7+ and CD8+CCR7+ T cells in G-PB were approximately 15-25 times more than those in G-BM. And the absolute counts of the above T cell subsets were not risk factors for acute GVHD(P>0.05).Conclusion: The quantity of T cell subsets may not be related to the occurrence of acute GVHD.

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目U1504806