妊娠期糖尿病大鼠胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12蛋白的表達*

郎麗翔,辛雅萍,豐樹煥,張蘇河,付艷芹

鄭州大學第二附屬醫院內分泌科 鄭州 450014

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妊娠期糖尿病大鼠胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12蛋白的表達*

郎麗翔,辛雅萍,豐樹煥,張蘇河,付艷芹#

鄭州大學第二附屬醫院內分泌科 鄭州 450014

摘要目的：探討內質網應激(ERS)及腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)、Caspase-12與妊娠期糖尿病(GDM)的關系。方法：60只健康雌性SD大鼠隨機分為4組：高脂高糖飲食受孕組(HP)、高脂高糖飲食未孕組(HV)、普通飲食受孕組(NP)、普通飲食未孕組(NV)，分別給予相應處理。測定妊娠末期空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、血脂，并計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，采用HE染色觀察胰腺組織形態學改變，TUNEL法檢測胰島細胞凋亡指數(AI)，免疫組化法測定GRP78表達，Western blot法測定TRAF2、Caspase-12蛋白表達。結果：妊娠和高脂高糖飲食均可使大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和血脂升高，二者具有協同作用(P<0.05)。妊娠第21天時，HP組胰島出現不同程度萎縮，細胞數量明顯減少，可見核固縮和核裂解；妊娠、高脂高糖飲食均可導致大鼠胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12表達升高，并且二者具有協同效應(P<0.05)。結論：妊娠和高脂高糖飲食均參與了ERS，ERS可能通過TRAF2-Caspase-12信號通路誘導胰島細胞凋亡,繼而參與GDM的發生發展。

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)，即妊娠期間發生或首次發現的不同程度的糖代謝異常，可導致不良妊娠結局。胰島β細胞數量減少，隨之引起胰島素分泌功能缺陷，是各種類型糖尿病的共同病理特征，而內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是引起胰島β細胞凋亡的關鍵環節[1]。 GRP78蛋白在ERS發生時表達上調，被認為是ERS的特異性標志物之一[2]。Caspase-12是Caspase家族成員之一，是介導細胞凋亡的一個主要因子。腫瘤壞死因子受體相關因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)與Caspase-12前體物的切割密切相關，在Caspase-12誘導細胞凋亡的過程中起重要作用[3]。目前有關GDM中TRAF2、Caspase-12與胰島細胞功能缺陷的關聯性研究較少。作者建立了一種GDM大鼠模型，通過分析其胰島細胞凋亡程度及胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12蛋白的表達，探討ERS引起胰島細胞凋亡的可能機制。

1材料與方法

1.1材料健康雌性SD大鼠60只[平均周齡4周，體重(105.84±9.94) g]，普通飼料、高脂高糖飼料均購自河南省實驗動物中心。血糖、血脂測定采用奧林帕斯全自動生化儀。胰島素放射免疫法測定試劑盒購自北京北方生物技術研究所。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。β-actin抗體、兔抗鼠TRAF2抗體、兔抗鼠Caspase-12抗體均購自Santa Cruz公司，二抗購自Zymed公司。

1.3實驗分組所有實驗大鼠給予普通飼料適應性喂養1周(標記為T1)，然后隨機分為4組(每組15只)：高脂高糖飲食受孕組(HP)、高脂高糖飲食未孕組(HV)、普通飲食受孕組(NP)、普通飲食未孕組(NV)，尾靜脈采血測定空腹血糖(FBG)。之后，HP、HV組大鼠給予高脂高糖飼料喂養，NP、NV組大鼠給予普通飼料喂養，6周后(標記為T2)測定FBG。然后，HP和NP組雌鼠受孕，按1.2操作。

1.4檢測指標

1.4.1血糖、血胰島素及血脂檢測妊娠第21天(即妊娠末期)，測定各組大鼠FBG，空腹胰島素(FINS)，血脂[總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)]，并計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)。

1.4.2胰腺組織HE染色所有雌性大鼠隔夜禁食12 h后，水合氯醛腹腔麻醉后，尾靜脈注射空氣3 mL處死動物，快速分離胰腺組織。取部分置于體積分數4%中性甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋，4～5 μm厚度切片，常規蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察胰腺組織的形態學變化。

1.4.3TUNEL法檢測胰島細胞凋亡指數取部分胰腺組織，嚴格按照TUNEL檢測試劑盒說明書進行操作。光鏡下觀察，細胞核深棕色著色為凋亡細胞。每只動物隨機選取不連續的3張切片，每張切片選取5個陽性細胞數最多的高倍視野，計數凋亡細胞數和總細胞數，凋亡指數(AI)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.4.4免疫組化法檢測胰腺組織中GRP78蛋白的表達胰腺組織切片常規脫蠟、水化，PBS洗滌3次，高溫高壓抗原修復5 min，自然冷卻后PBS洗滌，用二抗封閉，滴加一抗50 μL，室溫孵育1 h；滴加二抗50 μL，室溫孵育15 min。DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明及封片。光鏡下觀察，細胞質呈棕黃色染色為陽性細胞。應用醫學圖像分析系統進行平均光密度分析，計算GRP78蛋白的相對表達量。

1.4.5Western blot法檢測TRAF2、 Caspase-12蛋白的表達胰腺組織切塊并稱重，按每20 mg組織加100～200 μL蛋白裂解液的比例在冰水中勻漿裂解，14 000×g離心5 min，取上清。BCA法初步測定蛋白濃度。取約30 μg蛋白進行SDS-PAGE，100 V恒壓轉膜，封閉，4 ℃一抗孵育過夜，37 ℃二抗孵育45 min，ECL顯影，以β-actin為內參。將膠片掃描后用Bandscan 5.0軟件進行灰度分析。

1.5統計學處理應用SPSS 16.0進行統計學分析。HOMA-IR呈非正態分布，對其進行自然對數轉換后再行分析。采用2×2析因設計的方差分析對妊娠和高脂高糖飲食對大鼠血糖、胰島素、血脂的影響，以及對胰腺組織中AI、GRP78、TRAF2和Caspase-12蛋白表達的影響進行分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.14組大鼠不同時期血糖值的比較4組大鼠普通飼料適應性喂養1周后，FBG差異無統計學意義(P>0.05)；高脂高糖飼料喂養6周可使大鼠FBG顯著增高(表1)。

表1　4組大鼠飼養不同時期FBG的比較(n=15)　mmol/L

2.2妊娠末期4組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和血脂的比較見表2。妊娠第21天時，妊娠和高脂高糖飲食均可使大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和血脂升高，二者具有協同作用。

表2　4組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和血脂的比較(n=15)

2.34組大鼠胰腺組織形態學表現NV組胰島形態規則，細胞排列整齊，大小一致，胞質豐富，胞核多為圓形，核染色質清晰；NP組和HV組胰島形態尚規則，有少許出血發生，細胞數目減少，可見少許空泡變性發生；HP組胰島形態欠規則，出現不同程度的萎縮，細胞排列紊亂且數量明顯減少，部分細胞呈空泡變性，出現核固縮和裂解，可見以淋巴細胞、單核細胞為主體的炎癥細胞浸潤(圖1)。

A:NV組；B:NP組；C:HV組；D:HP組。圖1　4組大鼠胰腺組織形態學表現(HE，×400)

2.44組大鼠胰島細胞AI的比較見圖2、表3。妊娠和高脂高糖飲食均可使大鼠胰島細胞AI升高，但二者沒有協同作用。

A:NV組；B:NP組；C:HV組；D:HP組。圖2　4組大鼠胰島細胞凋亡的檢測(TUNEL,×400)

2.54組大鼠胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12表達的比較見圖3、圖4和表3。由表3可知，妊娠、高脂高糖飲食均可導致大鼠胰腺組織中GRP78、TRAF2、Caspase-12蛋白的表達升高，并且二者具有協同作用。

圖3　4組大鼠胰腺組織中TRAF2、Caspase-12蛋白的表達

A:NV組；B:NP組；C:HV組；D:HP組。圖4　4組大鼠胰腺組織中GRP78蛋白的表達(SP,×400)

組別AI/%GRP78TRAF2Caspase-12NV3.62±0.360.087±0.0110.14±0.010.14±0.02NP8.33±0.490.209±0.0070.36±0.020.48±0.03HV11.38±0.630.329±0.0220.28±0.020.21±0.02HP18.86±0.740.565±0.0210.79±0.040.84±0.04F妊娠(P)19.582(<0.001)811.498(<0.001)1309.910(<0.001)396.636(<0.001)F高脂高糖飲食(P)84.796(<0.001)2281.688(<0.001)2100.921(<0.001)1893.868(<0.001)F交互(P)0.016(0.900)82.259(<0.001)370.225(<0.001)167.787(<0.001)

3討論

細胞凋亡是多細胞生物體內細胞自我破壞的程序性過程。胰島細胞凋亡過多導致胰島細胞數量減少，是造成胰島細胞功能缺陷的一個主要原因。目前研究[5]認為，胰島素抵抗與胰島β細胞功能缺陷是GDM的主要發病機制。作者通過高脂高糖飲食誘導和妊娠建立GDM大鼠模型，結果顯示妊娠末期HP組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、血脂均明顯升高，符合GDM的病理特點[6]，提示GDM大鼠模型建立成功。HP組大鼠胰腺組織HE染色結果顯示胰島不同程度萎縮，細胞數量明顯減少且排列紊亂，出現細胞核固縮和裂解，而NV組胰島細胞形態規則且數目較多，提示HP組胰島細胞凋亡增加，與李佳[7]的研究結果一致。

目前認為，觸發細胞凋亡的信號轉導途徑大致分為3種：死亡受體途徑、線粒體途徑和ERS途徑。ERS是指由于各種原因導致內質網鈣穩態失衡，錯誤折疊或未折疊的蛋白質在內質網腔內聚集的一種病理狀態[8]。研究[9-10]表明，ERS在各種類型糖尿病胰島細胞凋亡過程中起重要作用。GRP78又稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BIP)，是熱休克蛋白70家族的成員之一，它是一種內質網分子伴侶，能使錯誤折疊的蛋白質恢復正確構象或促進其降解，是細胞自我保護的一種機制。GRP78參與前體蛋白轉運及其折疊、組裝和運輸，包括錯誤折疊和組裝蛋白質的輸出及相光降解，調節與ERS相關的3條主要信號通路(PERK、IRE-1、ATF-6)，調節內質網內穩態的諸多生物學過程[11-12]。

Caspase-12位于內質網膜胞質一側，是介導ERS誘發凋亡的關鍵分子，在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化[13]。Nakagawa等[14]研究發現，Caspase-12基因敲除的細胞能夠抵抗ERS誘導的細胞凋亡，而將激活的Caspase-12導入細胞則會促使細胞凋亡。曹延萍等[15]研究發現ERS特有凋亡途徑Caspase-12參與了糖尿病腎病足細胞的凋亡。TRAF2是一種細胞內信號接頭分子，在非應激細胞中，TRAF2可與Caspase-12前體蛋白形成穩定的復合物，發生ERS時，TRAF2與Caspase-12前體蛋白分離，引起Caspase-12活化。

該研究結果顯示，高脂高糖飲食和妊娠均可使大鼠血糖血脂及FINS和HOMA-IR增高；同時二者可使胰島細胞AI增加，可促使胰腺組織中GRP78蛋白和TRAF2、Caspase-12蛋白表達增加，說明妊娠、高脂高糖飲食均參與了ERS，二者交互作用，很可能通過增加ERS誘導的胰島細胞凋亡共同促進GDM的發生發展。

綜上所述，高脂高糖飲食和妊娠可參與ERS，ERS可能通過TRAF2-Caspase-12信號通路誘導胰島細胞凋亡繼而參與GDM的發生發展。推測可以通過干擾TRAF2-Caspase-12信號通路或ERS細胞凋亡不同環節減少胰島細胞凋亡，從而保護胰島功能，延緩GDM的發展，這將為臨床治療GDM提供全新的思路。

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(2015-10-22收稿責任編輯王曼)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.006

#通信作者，女，1976年9月生，碩士，副主任醫師，研究方向：糖尿病及其并發癥的防治，E-mail：fyq338916@163.com

中圖分類號R587.1

關鍵詞妊娠期糖尿病；內質網應激；凋亡；GRP78；TRAF2；Caspase-12；大鼠

Detection of expressions of GRP78,TRAF2,and Caspase-12 in pancreatic tissue of gestational diabetes mellitus rats

LANG Lixiang，XIN Yaping，FENG Shuhuan，ZHANG Suhe，FU Yanqin

DepartmentofEndocrinology，theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

Key wordsgestational diabetes mellitus;endoplasmic reticulum stress;apoptosis;GRP78;TNF receptor-associated factor 2;Caspase-12;rat

AbstractAim: To investigate the relationship of endoplasmic reticulum stress,TRAF2,Caspase-12 and the gestational diabetes mellitus(GDM)．Methods: A total of 60 healthy female SD rats were randomly allocated into four groups: pregnant group with high fat and sugar diet(HP),virgin group with high fat and sugar diet(HV),pregnant group with normal diet(NP),virgin group with normal diet(NV)．Fasting blood glucose(FBG),fasting serum insulin(FINS),and blood lipid of each group were tested in the late pregnancy, then the insulin resistance index(HOMA-IR) was calculated.The morpholog ical changes in pancreatic tissue were observed using HE staining，the apoptosis of islet cells was detected by TUNEL，and the expression of GRP78 was tested by immunohistochemistry， the expressions of TRAF2 and Caspase-12 were tested by Western blot. Results: Pregnancy and high fat and sugar diet could increase FBG,FINS,HOMA-IR,blood lipid synergistically(P<0.05).At the 21st day during pregnancy, pancreatic tissue appeared different degree of atrophy,islet cells decreased significantly，pyknosis and karyorrhexis could be seen in HP group. Pregnancy, high fat and high sugar diet were the main factors for increasing the GRP78, TRAF2, Caspase-12 expressions in rat pancreatic tissue, and they had synergistic effect(P<0.05). Conclusion: Pregnancy and high fat and sugar diet are involved in ERS;ERS might be involved in the development of GDM through inducing islet cell apoptosis by TRAF2-Caspase-12 signaling pathway.

*河南省醫學科技攻關計劃項目201403091