RP-HPLC法同時測定酶法合成阿莫西林工藝中的原料、中間體和產物的含量*

李永紅，周方方，付路平，馮利菲,劉宏民#

1)鄭州大學藥學院 鄭州 450001　2)鄭州大學新藥研究開發中心 鄭州 450001

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RP-HPLC法同時測定酶法合成阿莫西林工藝中的原料、中間體和產物的含量*

李永紅1,2)，周方方1,2)，付路平1,2)，馮利菲1,2),劉宏民1,2)#

1)鄭州大學藥學院 鄭州 4500012)鄭州大學新藥研究開發中心 鄭州 450001

摘要目的：建立同時測定酶法合成阿莫西林反應體系中原料、中間體和產物含量的反相高效液相分析方法。方法：以 Gemini-NX-C18為固定相；甲醇0.05 mol/L、pH 5.6的磷酸鹽緩沖液(V?V)為流動相；流速1.0 mL/min；檢測波長230 nm；進樣量10 μL；柱溫30 ℃進行檢測。 結果：6-氨基青霉烷酸、D-對羥基苯甘氨酸甲酯、D-對羥基苯甘氨酸、阿莫西林在各自的線性條件內線性關系良好，最低檢測限分別為4.00、1.00、0.04、1.00 mg/L。結論：該方法準確靈敏，適合同時測定酶法合成阿莫西林反應體系中原料、中間體和產物的含量。

阿莫西林(AMO)具有高效廣譜抗菌作用,而且不良反應很少， WHO推薦其作為首選的β-內酰胺類口服抗生素。工業上生產AMO通常用化學方法，步驟繁瑣，條件苛刻，而且污染嚴重。隨著人類環保意識逐漸增強，酶法合成β-內酰胺抗生素已經變得越來越受人關注[1]。目前，酶法合成AMO工藝已經比較成熟，轉化率也較高[2-4]。 采用一鍋法[5-6]，6-氨基青霉烷酸(6-APA)[7]和D-對羥基苯甘氨酸甲酯(HPGM)2種原料在青霉素酰化酶[8]的催化下直接生成了產物AMO[9]。在反應的過程中，一部分HPGM會水解生成D-對羥基苯甘氨酸(HPG)。生成的產物AMO也可能發生水解反應，水解產物是HPG、6-APA和甲醇，故酶促反應體系中6-APA、HPGM、HPG、AMO 4種物質共存。雖然有測定HPG[10]、6-APA[11]和AMO[12-13]的HPLC方法，但是未見到用RP-HPLC法同時檢測這4種物質含量的報道，作者對此進行了研究，現將結果報道如下。

1材料與方法

1.1儀器與試劑1200 HPLC儀、紫外檢測器(安捷倫科技有限公司)，Gemini-NX-C18型色譜柱(廣州菲羅門科技有限公司)，HYG-Ⅱa 型自動搖瓶柜(上海欣蕊自動化設備有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(鄭州凱鵬實驗儀器有限公司)，雷磁pHS-3C型酸度計(濟南東儀實驗室設備有限公司)，青霉素酰化酶(湖南福來格生物有限公司)，HPGM(純度97%，Ark Pharm Inc公司產品)，6-APA、HPG(純度99.4%)及AMO(純度85.8%)均購自中國藥品生物制品鑒定所，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2樣品和標準樣品的制備及RP-HPLC測定標準樣品的制備：分別精確稱取相應的標準品于容量瓶中，嚴格用相應的流動相溶解，配制成一系列的儲備液。各儲備液經過適當稀釋后，分別配制成單標溶液用于定性分析。再分別精密稱取相應的對照品，配制成一系列濃度的混合標準溶液，用于制作標準曲線、精密度及回收率等相關實驗。

樣品的制備：在28 ℃、180 r/min條件下加入相應的青霉素酰化酶和異辛醇，1 h后酶充分分散。采用一鍋法加入HPGM和6-APA，反應11 h后，旋轉蒸發儀蒸干，再用相應的流動相溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾后，用RP-HPLC法檢測體系中各物質的含量[14]。

根據6-APA和HPGM的分子結構、解離常數，HPGM易水解等性質，pH值對6-APA和HPGM的分離影響最大，以這2種化合物為主要研究對象，選擇3種不同pH值(5.0、5.6、6.0)的流動相對同一樣品分別進行測定[15-16]。實驗重復5次。

分別配制濃度為0.02、0.05和1.00 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，依次進樣，以塔板數、對稱因子、分離度為主要指標進行篩選。

由于6-APA和AMO 2種化合物的保留時間很接近，故選用不同的流動相配比使這2種化合物的分離度達到中國藥典要求。選擇甲醇和0.05 mol/L、pH值為5.6的磷酸鹽緩沖液做流動相，采用不同的流動相比例，對同一樣品進行測定，以確定最佳的流動相比例。實驗重復5次。

分別設置柱溫箱的溫度為25、30、35和40 ℃，依次進樣，以塔板數、對稱因子、分離度為主要指標進行篩選。

取不同濃度的混合標準溶液，用HPLC色譜圖峰面積對混合標準溶液濃度進行線性回歸和檢測限分析。

在酶法合成AMO反應體系中加入一系列的混合標準溶液，按照上述方法處理后進行加樣回收率分析。

2結果

2.1磷酸鹽緩沖溶液pH值的確定結果見表1。由表1可以看出，當pH值為5.6時，分離完全。因此流動相的pH值確定為5.6。

表1　流動相pH值對保留時間的影響(n=5)　min

2.2磷酸鹽緩沖溶液濃度的確定對不同濃度梯度的磷酸鹽緩沖溶液進行進樣分析，最終確定最適宜的流動相濃度為0.05 mol/L。

表2　流動相配比對分離度的影響(n=5)

2.4溫度的確定對不同的柱溫箱溫度進行進樣分析，最終確定柱溫箱的溫度為30 ℃。

2.5色譜圖以上述優化的反應條件，對轉化液進樣，色譜圖見圖1。

2.6標準曲線和檢測限結果見表3。由表3可知，4種化合物在各自的濃度范圍內線性關系良好。6-APA、HPGM、HPG、AMO的最低檢測限分別為4.00、1.00、0.04、1.00 mg/L。

從左至右依次為化合物HPG、6-APA、AMO及HPGM的色譜峰。圖1　轉化液的色譜圖

化合物線性方程6-APAY=2.6683X+0.026670HPGMY=15.664X-12.337HPGY=71.687X-90.802AMOY=14.280X+5.6919

2.7加樣回收率結果見表4。6-APA、HPGM、HPG、AMO的平均回收率分別為99.77%、99.47%、99.97%、98.90%，相對標準偏差分別為1.32%、1.49%、1.72%、1.31%。4種化合物的平均回收率和相對標準偏差均在誤差范圍內，結果可信。

表4　加樣回收率結果

3討論

作者利用此分析方法已經對酶法合成AMO的工藝條件進行了優化，主要包括酶解時間、溫度、酸堿度及底物濃度等條件。經過優化后，轉化效率提高了80%，成本大大降低。

參考文獻

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(2015-10-14收稿責任編輯姜春霞)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.005

#通信作者，男，1960年3月生，博士，教授，研究方向：藥物化學及糖化學，E-mail：liuhm@zzu.edu.cn

中圖分類號TQ460.7

關鍵詞阿莫西林；中間體；反相高效液相色譜法；酶法合成

Simultaneous determination of content of raw materials，intermediates， and products in process of enzymatic synthesis of amoxicillin by RP-HPLC

LI Yonghong1,2),ZHOU Fangfang1,2),FU Luping1,2)，FENG Lifei1,2),LIU Hongmin1,2)

1)DepartmentofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)NewDrugResearch&DevelopmentCenter，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

Key wordsamoxicillin;intermediate;RP-HPLC;enzymatic synthesis

AbstractAim: To establish a RP-HPLC method to simultaneously determine the content of raw materials, intermediates, and products in the process of enzymatic synthesis of amoxicillin.Methods: The determination was performed on a Gemini-NX-C18 column with a 90 mixture of methanol and phosphate buffer solution(0.05 mol/L, pH 5.6) as mobile phase, 1.0 mL/min as flow rate, 230 nm as determination wavelength, and 10 μL as injection volume with column temperature of 30 ℃.Results: The content of 6-APA, HPGM, HPG, and amoxicillin had good linear relationship in certain range and the limits of the detection were 4.00, 1.00, 0.04, and 1.00 mg/L, respectively. Conclusion: The method is accurate, sensitive and suitable to simultaneously determine the content of raw materials, intermediates, and products in the process of enzymatic synthesis of amoxicillin.

*國家自然科學基金資助項目21402178