表皮生長因子受體在臭氧致小鼠肺部炎癥中的作用*

晉樂飛,吳衛東,段麗菊,段書音,胡　鵬,馮斐斐

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001　2)新鄉醫學院公共衛生學院勞動衛生學教研室 新鄉 453000　3)鄭州大學公共衛生學院環境衛生學教研室 鄭州 450001　4)鄭州大學公共衛生學院毒理學教研室 鄭州 450001

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表皮生長因子受體在臭氧致小鼠肺部炎癥中的作用*

晉樂飛1),吳衛東2),段麗菊3),段書音3),胡鵬3),馮斐斐4)#

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 4500012)新鄉醫學院公共衛生學院勞動衛生學教研室 新鄉 4530003)鄭州大學公共衛生學院環境衛生學教研室 鄭州 4500014)鄭州大學公共衛生學院毒理學教研室 鄭州 450001

摘要目的：探討表皮生長因子受體(EGFR)在臭氧致小鼠肺部炎癥中的作用。方法：40只SPF級BALB/c小鼠隨機分為4組(n=10)，分別暴露于空氣或0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧中，每天暴露3 h，連續暴露7 d。HE染色觀察小鼠肺部炎癥病理學改變，并進行評分；免疫組化法檢測小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平；雙抗夾心ELISA法測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中趨化因子CXCL1的含量。結果：0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧組小鼠肺組織炎癥評分均高于空氣組(P均<0.05)，小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平和BALF中趨化因子CXCL1的表達水平亦均高于空氣組(P均<0.05)。相關分析結果顯示，小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與小鼠肺組織炎癥病理學變化總分(r=0.652, P=0.030)、BALF中趨化因子CXCL1表達水平(r=0.925, P<0.001)均呈正相關。結論：EGFR磷酸化可能與臭氧誘導的小鼠肺部炎癥有關。

臭氧是一種強氧化性的氣體，主要分布在大氣的同溫層，被稱為“地球生命的保護傘”。但是，出現在對流層的臭氧主要源于光化學反應，是一種二次污染物。近年來，中國大氣污染特征已經從煤煙型污染轉變成為煤煙、交通、氧化型等共存的復合型污染，環境中的氮氧化物(NOx)排放量日益升高。在溫度適宜的情況下，NOx和空氣中的揮發性有機物在日光紫外線的照射下，經過一系列的光化學反應生成一種刺激性很強的淺藍色煙霧，其主要成分就是臭氧[1-2]。越來越多的流行病學研究[3-4]證實，長期吸入臭氧可導致呼吸系統疾病的發病率和病死率升高。肺部炎癥是呼吸系統疾病最重要的特征，動物實驗和人體試驗研究[5-6]表明，臭氧能夠引起機體肺部炎癥。盡管臭氧導致肺部炎癥的機制還不清楚，但是近年來的體外研究[7]表明，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)可能與臭氧誘導的肺部炎癥有關。該研究旨在通過動物實驗探究EGFR是否參與了臭氧所致的肺部炎癥，為進一步研究臭氧誘導肺部炎癥的作用機制提供線索。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組40只SPF級BALB/c小鼠，體重20～30 g，雌雄各半，均購自河南省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(豫)2010-0002，常規飼養于鄭州大學公共衛生學院動物房，實驗動物使用許可證號：SYXK(豫)2012-0007。40只小鼠采用隨機數字表法分為4組，每組10只，分別暴露于空氣或0.5、1.0、2.0 mg/m3的臭氧。

1.1.2試劑和儀器EGFR(Y1068)磷酸化抗體(Cell Signaling公司)；小鼠趨化因子CXCL1 ELISA檢測試劑盒(武漢華美公司)；動式染毒柜(天津合普公司，型號：HOPE-MED 8050)；便攜式臭氧發生器(廣州創環公司，型號：CH-KTB2G)；便攜式室內Z-1200臭氧檢測儀(Environmental Sensors公司)；EGFR(Y1068)磷酸化免疫組化二抗(武漢博士德公司)；顯微鏡顯影系統(Olympus公司，型號：BH-2)；Image-Pro Plus 6.0圖像采集分析系統；酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.2臭氧暴露采用便攜式臭氧發生器產生臭氧，通過調節臭氧發生器和流量計將臭氧濃度分別控制在0.5、1.0、2.0 mg/m3，并連接動式染毒柜將臭氧導入動式染毒柜的暴露室中，染毒組小鼠放入臭氧暴露室，空氣組小鼠放入空氣暴露室，每天暴露3 h，持續7 d。

1.3支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的收集與趨化因子CXCL1的檢測暴露結束后第2天，水合氯醛麻醉處死7只小鼠，用剪刀從小鼠的頸部剪開，暴露主氣管，剪一斜口，插入帶有聚乙烯管的肺灌洗針頭，用5 mL一次性注射器緩緩注入1 mL生理鹽水，停留30 s，然后取下注射器，讓BALF回流入1.5 mL的EP管。BALF經4 ℃、1 500 r/min離心10 min后，收集上清并置于-20 ℃冰箱保存。采用雙抗夾心ELISA法測定BALF中趨化因子CXCL1的含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4肺組織HE染色病理學觀察與炎癥評分暴露結束后第2天，水合氯醛麻醉處死3只小鼠，取右上葉肺置于體積分數10%的甲醛溶液中充分固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚切片，置烤箱中65 ℃烤片2 h，石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后進行HE染色，再經脫水、透明后，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。根據張妍迪等[8]的分級評分標準進行肺部炎癥評分。

1.6統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。各組間小鼠肺組織炎癥評分、支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平、BALF中趨化因子CXCL1表達水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與炎癥病理學改變總分、BALF中趨化因子CXCL1表達水平的關系采用Pearson相關進行分析。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1小鼠一般體征暴露期間各組小鼠正常飲水、進食，臭氧組小鼠在暴露期間可見呼吸急促、精神萎靡。

2.2肺組織病理學觀察與炎癥評分結果見圖1、表1。由圖1可知，空氣組小鼠支氣管上皮結構完整，纖毛排列整齊；0.5 mg/m3臭氧組小鼠支氣管上皮可見輕度纖毛脫落；1.0 mg/m3臭氧組小鼠支氣管上皮出現部分增厚或纖毛脫落，周圍有炎性細胞的浸潤；2.0 mg/m3臭氧組小鼠支氣管腔有少量分泌物，支氣管上皮增厚，纖毛缺損，周圍有大量炎性細胞浸潤。由表1可知，0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧組小鼠的各項評分與總分均高于空氣組，差異有統計學意義。

A:空氣組；B:0.5 mg/m3臭氧組；C:1.0 mg/m3臭氧組；D:2.0 mg/m3臭氧組。圖1　各組小鼠肺組織HE染色結果(×400)

組別n炎性細胞浸潤肺氣腫上皮細胞損傷黏液分泌總分空氣組30.33±0.340.22±0.190.67±0.340.11±0.190.54±0.270.5mg/m3臭氧組31.33±0.34*1.44±0.20*2.00±0.33*1.33±0.34*1.53±0.18*1.0mg/m3臭氧組32.44±0.84*2.11±0.19*#1.67±0.67*1.97±0.34*1.97±0.38*2.0mg/m3臭氧組33.44±0.20*#3.44±0.51*#△2.89±0.19*#2.78±0.39*#△3.14±0.21*#△F22.68158.47514.46535.22748.200P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3臭氧暴露對小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平的影響結果見圖2、表2。由圖2可知，EGFR(Y1068)的磷酸化集中表現在支氣管上皮組織，肺泡上皮也有少量磷酸化。由表2可知，0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧組的AOD值均高于空氣組，差異有統計學意義。

A:空氣組；B:0.5 mg/m3臭氧組；C:1.0 mg/m3臭氧組；D:2.0 mg/m3臭氧組。圖2　各組小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化情況(SP,×400)

組別nAOD值空氣組30.051±0.0070.5mg/m3臭氧組30.146±0.047*1.0mg/m3臭氧組30.208±0.003*2.0mg/m3臭氧組30.162±0.050*

F=11.110,P=0.003;*：與空氣組比較，P<0.05。

2.4臭氧暴露對小鼠BALF中炎癥趨化因子CXCL1表達的影響結果見表3。由表3可知，與空氣組相比，0.5、1.0、2.0 mg/m3臭氧組小鼠BALF中炎癥趨化因子CXCL1的表達水平均升高，差異有統計學意義。

表3　各組小鼠BALF中趨化因子CXCL1的表達水平

F=3.818,P=0.029;*：與空氣組比較，P<0.05。

2.5小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與炎癥病理學改變總分、BALF中趨化因子CXCL1表達水平的關系小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與小鼠肺組織炎癥病理學改變總分(r=0.652,P=0.030)、BALF中趨化因子CXCL1表達水平(r=0.925,P<0.001)均呈正相關。

3討論

臭氧是一種強氧化性的空氣污染物，主要通過呼吸道吸入對機體的健康產生危害[1]。流行病學研究[3]表明，呼吸系統疾病的發病率和病死率的升高與環境中臭氧水平的上升密切相關；環境中臭氧的8 h最大平均濃度每升高0.01 mg/m3，呼吸系統疾病的死亡風險將升高0.5%[9]。研究[8]發現，短期吸入臭氧能夠導致機體肺部炎癥；并且，課題組前期的研究[7]結果表明，臭氧暴露可激活胞漿Src激酶，活化的Src激酶進而催化上皮細胞EGFR的磷酸化，而后者可上調人支氣管上皮細胞內IL-8(與小鼠CXCL1基因同源)的表達。該研究的目的在于從生物整體水平探討EGFR在臭氧致小鼠肺部炎癥中的作用。

該研究結果顯示，臭氧暴露能夠導致小鼠肺組織的炎癥病理學變化，炎性細胞浸潤、肺氣腫、上皮細胞損傷、黏液分泌等各項評分和總分均明顯升高。同時，臭氧暴露還能上調BALF中趨化因子CXCL1的表達。趨化因子CXCL1屬于CXC趨化因子家族，是由巨噬細胞、中性粒細胞和上皮細胞表達的小分子細胞因子，通過對中性粒細胞的趨化作用參與炎癥反應[10-11]。該課題組研究[12-13]發現，氧化應激在空氣污染物(鋅離子、臭氧)誘導呼吸道炎癥中發揮著起始作用，氧化應激能夠激活氧化還原相關轉錄因子核因子-κB(NF-κB)，進一步介導IL-8、趨化因子CXCL1等促炎性因子的表達[12,14]，正是氧化應激產物和這些促炎性因子最終導致了支氣管上皮的損傷和炎癥反應。因此，這說明臭氧可能通過氧化應激誘導小鼠肺部炎癥和損傷，并且臭氧暴露劑量越高，炎癥和損傷的程度越嚴重。

該研究結果顯示，臭氧濃度為0.5 mg/m3即可導致小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平和BALF中趨化因子CXCL1的表達水平升高。并且相關分析結果顯示，小鼠支氣管上皮EGFR(Y1068)磷酸化水平與肺組織炎癥病理學改變總分、BALF中趨化因子CXCL1的表達水平均呈正相關。EGFR在呼吸系統疾病的發生和發展中作用已被廣泛認可，并可能起著關鍵作用[7]。EGFR是一種單鏈跨膜受體，全蛋白主要分為胞外配體結合域、跨膜域和胞內的酪氨酸激酶區，其中胞內的酪氨酸激酶區包含Y1068、Y1148、Y1173等3個主要的自磷酸化位點[15]。雖然臭氧激活體內EGFR的機制還不清楚，但是可以肯定的是，EGFR的磷酸化能夠進一步激活下游的多條信號通路，從而調控IL-8和趨化因子CXCL1等促炎性因子的表達[7,14]。因此，該研究結果提示，EGFR在臭氧誘導的小鼠肺部炎癥中發揮著重要的調控作用。

綜上所述，EGFR的磷酸化與臭氧誘導的小鼠肺部炎癥有關，但是EGFR在臭氧誘導小鼠肺部炎癥中的作用機制還有待進一步研究。

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(2015-10-08收稿責任編輯姜春霞)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.004

#通信作者，女，1983年4月生，博士，講師，研究方向：環境污染物引起的肺部損傷，E-mail:feifeifeng@zzu.edu.cn

中圖分類號R122.2

關鍵詞小鼠；表皮生長因子受體；臭氧；炎癥；CXCL1

Role of EGF receptor in ozone-induced lung inflammation in mice

JIN Yuefei1), WU Weidong2), DUAN Liju3), DUAN Shuyin3), HU Peng3), FENG Feifei4)

1)DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang4530003)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)DepartmentofToxicology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsmouse; epidermal growth factor receptor; ozone; inflammation; CXCL1

AbstractAim: To explore the role of epidermal growth factor receptor(EGFR) in ozone-induced lung inflammation in mice. Methods: Forty BALB/c mice were randomly allocated into four groups(n=10), and then exposed to air or 0.5, 1.0, 2.0 mg/m3 ozone(3 h/d for 7 d), respectively. Inflammatory and pathological alterations were observed by HE staining. Phosphorylation of EGFR(Y1068) in bronchial epithelium was examined using immunohistochemical staining. Level of CXCL1 expression in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of mice was measured using ELISA. Results: Compared with air-exposed mice, scores of inflammatory and pathological alterations were increased after exposure to 0.5, 1.0, 2.0 mg/m3 ozone(P<0.05). 0.5, 1.0, 2.0 mg/m3 ozone exposure elevated levels of phosphorylated EGFR(Y1068) in bronchial epithelium(P<0.05). In addition, level of CXCL1 expression in BALF of 0.5, 1.0, 2.0 mg/m3 ozone-exposed mice was increased(P<0.05). There were positive correlation between level of phosphorylated EGFR(Y1068) and total score of inflammatory and pathological alterations(r=0.652, P=0.030), CXCL1 expression in BALF(r=0.925, P<0.001).Conclusion: Phosphorylation of EGFR(Y1068) in bronchial epithelium is related to ozone-induced lung inflammation in mice.

*國家自然科學基金面上項目81373030，81402712；鄭州大學優秀青年教師發展基金資助項目1421329082

*：與空氣組比較，P<0.05；#：與0.5 mg/m3臭氧組比較，P<0.05；△：與1.0 mg/m3臭氧組比較，P<0.05。