rhMG53蛋白聯合hUC-MSCs移植對阿爾茨海默鼠的治療作用*

宋及時，馬珊珊#，孟　楠，王欣欣，姚　寧，朱相展，程　康，楊　波，關方霞1,#

1)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州 450052　3)中美(河南)荷美爾腫瘤研究院 鄭州 450000

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rhMG53蛋白聯合hUC-MSCs移植對阿爾茨海默鼠的治療作用*

宋及時1)，馬珊珊1)#，孟楠2)，王欣欣2)，姚寧3)，朱相展3)，程康1)，楊波2)，關方霞1,2)#

1)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 4500012)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州 4500523)中美(河南)荷美爾腫瘤研究院 鄭州 450000

摘要目的：研究rhMG53蛋白聯合人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)移植對阿爾茨海默模型鼠(APP轉基因小鼠)的治療作用。方法：40只APP+小鼠隨機分為APP+組、hUC-MSCs組、rhMG53組和rhMG53聯合hUC-MSCs組(聯合組)，分組處理1周后采用免疫組化法檢測小鼠腦內hUC-MSCs的遷移率，3周后采用Morris水迷宮測試各組小鼠的學習和記憶能力，同時檢測小鼠血清中SOD的活性和MDA的含量，并采用qRT-PCR和Western blot檢測小鼠腦組織中衰老相關基因(sirt2、pCNA、p16、p53)的表達。結果：APP+組和rhMG53組未見hUC-MSCs遷移，hUC-MSCs組和聯合組存在hUC-MSCs遷移，且聯合組遷移細胞更多(P<0.05)。hUC-MSCs移植可以使APP+小鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增加以及平臺所在象限停留時間增加(P<0.05)；hUC-MSCs移植和rhMG53均可使APP+小鼠血清SOD活性增加，MDA含量下降，且二者聯用對MDA的影響有協同作用(P<0.05)；hUC-MSCs移植和rhMG53均可使APP+小鼠腦組織sirt2和pCNA mRNA和蛋白的相對表達量升高，且二者聯用對多數衰老相關基因表達的影響有交互作用(P<0.05)。結論：外源rhMG53蛋白可以提高小鼠腦內hUC-MSCs的遷移，促進hUC-MSCs對阿爾茨海默鼠的治療作用。

干細胞移植為腦損傷、脊髓損傷等中樞神經系統損傷疾病的治療帶來了希望，取得了令人鼓舞的結果[1]。但是損傷部位的微環境導致移植后干細胞的存活率低且遷移至損傷組織的數量少，從而影響了治療效果[2]。因此，增強干細胞的靶向遷移能力、增加到達損傷區的移植細胞的數量是目前亟待解決的問題。研究[3]表明外源的重組人MG53蛋白(recombinant human mitsugumin 53 protein，rhMG53)對于各種肌肉或非肌肉細胞(骨骼肌、心肌、上皮、免疫和神經細胞以及胚胎腭突間充質細胞)損傷均有保護作用，可快速定位到損傷部位，在細胞膜修復中發揮關鍵作用；此外，rhMG53蛋白對肺、心肌損傷等急性損傷具有損傷保護和修復治療作用[4-5]。那么rhMG53蛋白在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)慢性病理環境下對人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)移植治療是否具有促進作用？該研究觀察了rhMG53聯合hUC-MSCs移植對AD模型小鼠的治療作用。

1材料與方法

1.1材料rhMG53由美國俄亥俄州州立大學麻建杰教授提供；hUC-MSCs由課題組前期凍存；DMEM/F12培養基、免疫組化試劑盒購自寶信生物科技有限公司；胎牛血清購自美國Gemini公司；DNA小提試劑盒、Trizol、逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；引物，兔抗人抗體(Sirt2、PCNA、P16、P53)，鼠抗人MAB1281單克隆抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司；血清SOD活性測定試劑盒及血清MDA含量測定試劑盒購自南京建成生物公司。

1.2AD模型小鼠的鑒定與分組清潔級C57BL/6 APP轉基因小鼠購自中國協和醫科大學動物所，合籠繁殖。實驗選用4月齡小鼠，采用PCR技術進行鑒定：剪取0.3 cm鼠尾，提取全DNA，PCR擴增APP基因，擴增引物序列為： 5’-CCCTGAACCT GAAACATAAAAT-3’和5’-GCTACGAAAATCCAAC CTACAA-3’，經瓊脂糖凝膠電泳共鑒定出40只APP+小鼠，然后按隨機數字表法分為APP+組、hUC-MSCs組、rhMG53組和rhMG53聯合hUC-MSCs組(聯合組)，每組10只。APP+組小鼠通過尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水，hUC-MSCs組同法注射0.2 mL細胞密度為5×106mL-1的第3代hUC-MSCs懸液，rhMG53組按2 mg/kg注射0.2 mL rhMG53，聯合組小鼠注射含細胞密度為5×106mL-1的第3代hUC-MSCs和含rhMG53(2 mg/kg) 的混合液0.2 mL。1次/d，共3 d。

1.4Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力小鼠注射結束后3周進行適應性訓練1周，然后進行空間探索實驗。撤去平臺，小鼠分別從4個象限的固定位置入水，觀察并利用攝像采集器記錄小鼠游泳軌跡，統計穿越平臺次數、逃避潛伏期和平臺所在象限停留時間等參數。

1.5小鼠血清SOD活性和MDA含量檢測Morris水迷宮實驗結束后，各組分別選取3只小鼠，活體心臟取血，2 000×g離心5 min，收集上清，-80 ℃保存。根據南京建成生物公司試劑盒說明書推薦方法使用酶標儀檢測小鼠血清中SOD活性，使用分光光度法檢測小鼠血清中MDA含量。

1.6小鼠腦組織衰老相關基因(sirt2、pCNA、p16、p53)mRNA和蛋白表達的檢測Morris水迷宮實驗結束后，各組分別取3只小鼠，處死后取出腦組織，勻漿后Trizol裂解法提取總RNA，測RNA濃度和完整性后-80 ℃保存。取500 ng總RNA，反轉錄合成cDNA。以小鼠GAPDH為內參，根據試劑盒說明書配制反應體系，進行qRT-PCR，每個樣品設3個復孔。數據分析采用比較Ct法，相對表達量=2-ΔΔCt，重復3次。實驗所用相關引物序列參考課題組前期文獻[6]報道。

1.7統計學處理采用SPSS 19.0處理數據。應用兩獨立樣本t檢驗比較hUC-MSCs組和聯合組hUC-MSCs遷移數量，應用析因設計的方差分析比較rhMG53和hUC-MSCs移植對水迷宮實驗結果、血清中SOD活性及MDA含量、腦組織中衰老相關基因mRNA及蛋白相對表達量的影響，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1APP轉基因小鼠的鑒定經PCR擴增，電泳結果顯示在284 bp處有條帶(圖1)，為APP轉基因鼠，共獲得40只APP+小鼠。

M：100 bp Marker；1和6為APP-小鼠，其余為APP+小鼠。圖1　APP轉基因小鼠鑒定的PCR產物電泳圖

2.24組小鼠腦組織hUC-MSCs的遷移APP+組和rhMG53組未見hUC-MSCs遷移，hUC-MSCs組和聯合組小鼠腦組織中hUC-MSCs的遷移數分別為(54.66±3.53)和(129.33±4.97) mm-2，且聯合組高于hUC-MSCs組(t=12.238,P<0.001)。

2.34組小鼠學習記憶能力的檢測Morris水迷宮測試結果見表1。hUC-MSCs移植可使APP+小鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數以及平臺所在象限停留時間增加。

表1　4組小鼠水迷宮測試結果

2.44組小鼠血清SOD活性及MDA含量的比較見表2。hUC-MSCs移植和rhMG53均可使APP+小鼠血清中SOD活性增加，MDA含量下降，二者聯用對MDA的影響具有協同效應。

表2　4組小鼠血清SOD活性及MDA含量的變化

2.54組小鼠腦組織中衰老相關基因mRNA和蛋白表達量的變化結果見圖2，表3、4。

1～4：分別為APP+組、hUC-MSCs組、rhMG53組和聯合組。圖2　4組小鼠腦組織中衰老相關蛋白的表達

hUC-MSCs移植和rhMG53均可使小鼠腦組織中sirt2和pCNA基因mRNA和蛋白的相對表達量升高，p16、p53 mRNA和蛋白的相對表達量下降；hUC-MSCs與rhMG53聯用對多數衰老基因mRNA和蛋白表達的影響有協同作用。

表3　4組小鼠腦組織中衰老相關基因mRNA的表達變化

表4　4組小鼠腦組織中衰老相關基因蛋白水平的表達變化

3討論

AD是一種神經系統退行性疾病，主要表現為認知功能障礙和行為異常[7]。干細胞通過替代受損神經元或者分泌營養因子對AD起到治療作用[8]。提高外源性干細胞在腦內的存活和遷移效率是提高干細胞治療效果亟待解決的問題[9]。

MG53蛋白在腦組織中不表達[10]，但能夠保護體外培養的神經細胞，參與神經細胞的損傷修復[3]；而且rhMG53能夠保護體外培養的骨髓間充質干細胞免受氧化損傷[11]。該研究以外源rhMG53蛋白為切入點，研究rhMG53對hUC-MSCs治療APP+鼠的影響。作者首先采用Morris水迷宮測試了各組小鼠行為學變化，結果發現hUC-MSCs移植可使AD小鼠逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數增多、平臺所在象限停留時間增加，與已有文獻[12-13]報道一致，但未發現hUC-MSCs和rhMG53有協同作用。MAB1281是人細胞核的特異性抗體，用MAB1281作為指示能夠鑒定外源的hUC-MSCs在小鼠組織中的遷移。該研究發現rhMG53聯合hUC-MSCs治療組較單用hUC-MSCs組hUC-MSCs的遷移明顯增多，說明rhMG53對體內hUC-MSCs的損傷發揮保護作用，并促進其存活和遷移。生化水平上，SOD活性直接反映機體清除自由基的能力，而MDA含量反映了機體內自由基積累程度和脂質過氧化損傷程度，二者可反映體內的氧化水平。該研究結果顯示hUC-MSCs移植可使小鼠血清SOD活性升高，MDA含量降低，說明機體的抗氧化水平提高，降低了氧化應激的損害，且聯合組血清MDA含量較hUC-MSCs組更低。分子水平上，作者檢測了腦組織中衰老相關基因的表達，結果發現rhMG53和hUC-MSCs移植均可使增殖活力相關基因sirt2、pCNA的表達增加，而衰老相關基因p16、p53的表達降低，說明rhMG53和hUC-MSCs移植能夠不同程度提高腦組織細胞的活力，延緩AD小鼠的衰老，并且二者聯用對多數衰老相關基因有協同作用。

綜上所述，hUC-MSCs可以改善AD鼠的學習和記憶能力，提高小鼠體內的抗氧化水平、延緩AD的衰老進程；rhMG53可促進hUC-MSCs的遷移和存活，二者聯合較hUC-MSCs單一治療效果更加明顯，可能在AD治療中具有潛在的應用價值。

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(2015-10-29收稿責任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.002

#通信作者：關方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細胞與再生醫學， E-mail: guanfangxia@126.com；馬珊珊，女，1984年5月生，博士，副教授，研究方向:干細胞生物學特性分析，E-mail: mashanshan84@163.com

中圖分類號R592

關鍵詞rhMG53；阿爾茨海默病；間充質干細胞；干細胞移植；小鼠

Therapeutic effects of rhMG53 combination with hUC-MSCs transplantation on Alzheimer′s disease mice

SONG Jishi1), MA Shanshan1), MENG Nan2), WANG Xinxin2), YAO Ning3), ZHU Xiangzhan3), CHENG Kang1), YANG Bo2), GUAN Fangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500523)China-US(Henan)HormelCancerInstitute，Zhengzhou450000

Key wordsrhMG53;Alzheimer′s disease;mesenchymal stem cell;stem cell transplantation；mouse

AbstractAim: To research the effects of rhMG53 combination with hUC-MSCs transplantation on Alzheimer′s disease mice. Methods: Forty APP+ mice were randomly allocated into four groups: APP+ group, hUC-MSCs group, rhMG53 group and rhMG53 combined with hUC-MSCs group. The migration of hUC-MSCs was quantified by immunohistochemistry at one week after transplantation. And the learning and memory ability was measured by Morris water maze test at three weeks after transplantation. The activity of superoxide dismutase(SOD) and the concentration of malonaldehyde(MDA) in the serum were also quantified. qRT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of senescence related factors(sirt2,pCNA,p16,p53). Results: No migration of hUC-MSCs was found in APP+ group or rhMG53 group, while it was observed in the hUC-MSCs group and the combined group, and the amount of migration cells was higher in the combined group(P<0.05). hUC-MSCs transplantation decreased the escaping latency, increased the times of crossing platform and the time spent in the platform quadrant(P<0.05). hUC-MSCs transplantation and rhMG53 could both increase the activity of SOD and decrease the content of MDA in the serum of APP+ mice, and rhMG53 combined with hUC-MSCs transplantation had synergistic effect on MDA(P<0.05). hUC-MSCs transplantation and rhMG53 could both increase the expressions of sirt2 and pCNA mRNA and protein in the brain tissue of APP+ mice, and rhMG53 combined with hUC-MSCs transplantation had synergistic effect on the expression of most aging genes(P<0.05).Conclusion: rhMG53 can improve the migration of hUC-MSCs in brain tissue of APP+ mice, and promote the therapeutic effect of hUC-MSCs on APP+ mice.

*國家自然科學基金資助項目81471306,U1404313；河南省科技創新人才計劃154200510008；河南省高校科技創新團隊支持計劃15IRTSTHN022；河南省產學研合作項目142107000008