1-甲基-2-喹諾酮類衍生物的合成及其抗腫瘤活性

陳春雪, 尤朋濤, 劉焱文, 陳　新

(湖北中醫藥大學 中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室，湖北 武漢　430065)

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1-甲基-2-喹諾酮類衍生物的合成及其抗腫瘤活性

陳春雪, 尤朋濤, 劉焱文, 陳新*

(湖北中醫藥大學 中藥資源與中藥化學湖北省重點實驗室，湖北 武漢430065)

摘要：以喹啉類化合物為原料，經甲基化反應和氧化反應制得中間產物2-喹諾酮類化合物(2a～2c)； 2a～2c經硝化反應制得7個硝化-2-喹諾酮類化合物(3a～3g)； 3a, 3e～3g經移位取代反應合成了4個1-甲基化-4-氰化-2-喹諾酮類衍生物(4a, 4e～4g)，其結構經1H NMR，13C NMR和HR-MS(EI)確證。采用MTT法評價了化合物對MCF-7, H1299, A549, PC-12, CT-26及HepG-2腫瘤細胞的抗增殖作用。研究結果表明：部分化合物對腫瘤細胞的抑制活性明顯高于喹啉系列物，其中1,8-二甲基-3,5,7-三硝基-2-喹諾酮(3e)顯著抑制六種腫瘤細胞的增殖，對A549的抑制活性最高，IC50為2.05 μmol·L-1； 1-甲基-6,8-二硝基-4-氰基-2-喹諾酮(4a)可選擇性抑制A549和CT-26腫瘤細胞，IC50分別為9.34 μmol·L-1和18.43 μmol·L-1。

關鍵詞：喹啉; 2-喹諾酮衍生物; 移位取代反應; 合成; 抗腫瘤活性

喹諾酮類，又稱吡啶酮酸類，最早是通過化學合成法得到具有抗菌活性的藥物，根據酮基的位置，可分為2-喹諾酮類和4-喹諾酮類兩大類[1]。天然2-喹諾酮類化合物主要存在于蕓香科植物中，并具有一定的生理活性，如從吳茱萸干燥近成熟果實中分離得到3-二甲基-4-甲氧基-2-喹諾酮，進一步的藥理研究表明該生物堿成分具有免疫抑制、抗腫瘤、松弛血管平滑肌、選擇性的抑制幽門螺桿菌及抗蠕蟲等作用；從黃皮屬植物中分離得到的2-喹諾酮類化合物對A549, BGC-823和HeLa細胞具有明顯的細胞毒活性；從蜆殼花椒中首次分離出生物堿4-甲氧基-2-喹諾酮,研究發現其具有與抗老年癡呆活性相關的內酯胺結構；從野花椒中發現的2-喹諾酮類單體化合物加錫果寧對缺氧，缺血動物具有保護作用，野花椒堿可以抑制由凝血酶誘導的血小板凝集，4-甲氧基-1-甲基-2-喹諾酮可以選擇性的抑制由花生四烯酸誘導的血小板凝集；從單面針中發現了4-甲氧基-1-甲基-2-喹諾酮具有抗氧活性[2-9]。

Scheme 1

近年來，隨著喹諾酮類化合物抗腫瘤作用機制與抗菌作用機制相似的研究發現，兩者均為通過拓撲異構酶Ⅱ調節DNA分子內或分子間鏈接的多基因酶系而快速抑制腫瘤。2-喹諾酮類作為一類新型的抗癌藥物，已經成為抗腫瘤藥物研發的方向之一。已報道的人工合成的2-喹諾酮類化合物，往往具有廣泛的藥理活性作用，如細胞毒活性[10]、SRSA拮抗劑[11]、煙堿受體激動劑[12]、抗貧血活性[13]、抗親緣活性[14]、抗微生物活性[15]、抗菌活性[16]、糜酶抑制作用[17]和二肽基肽酶IV抑制作用[18]等。喹諾酮骨架是藥物分子和生物活性物質中廣泛存在的優勢結構。

基于此，本文設計并合成2-喹諾酮類衍生物，并研究其構效關系，以期找到新型抗腫瘤2-喹諾酮類藥物。以喹啉類化合物(1a～1c)為起始原料，經甲基化反應和氧化反應制得中間產物2-喹諾酮類化合物(2a～2c)； 2a～2c經硝化反應制得7個硝化-2-喹諾酮類化合物(3a～3g)； 3a, 3e～3g經移位取代反應合成了4個1-甲基化-4-氰化-2-喹諾酮類衍生物(4a, 4e～4g， Scheme 1)，其結構經1H NMR，13C NMR和HR-MS(EI)確證。并采用MTT法評價了目標化合物對MCF-7, H1299, A549, PC-12, CT-26及HepG-2腫瘤細胞的抗增殖作用。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Yanaco型數字顯微熔點儀；Bruker Ascend-400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；JASCO FT/IR-4200型紅外光譜儀；JEOL JMS-DX303HF型質譜儀；Sheldon CO2型恒溫培養箱；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺；CK2型倒置顯微鏡；BIO-RAD型酶標儀。

人乳腺癌細胞MCF-7，人肺癌細胞H1299和A549，大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤PC-12細胞，小鼠的大腸癌細胞CT-26，人肝癌細胞HepG-2， ATCC細胞庫；四甲基偶氮唑藍MTT(武漢飛羿科技有限公司)；Gibco FBS； RPIM-1640培養基，HyClone公司；胰蛋白酶，HyClone公司；PBS磷酸鹽緩沖液；其余試劑均為分析純或化學純。

1.2合成[19]

(1) 2a～2c的合成(以2a為例)

在反應瓶中加入喹啉(1a)5.41 mL(45.8 mmol)，攪拌下緩慢滴加硫酸二甲酯4.34 mL(45.8 mmol)，滴畢(約10 min)，于60 ℃反應30 min。加入15 mL水淬滅反應，冰浴冷卻下同時滴加K3[Fe(CN)6] 32.28 g(98 mmol)的水(128 mL)溶液和NaOH 8.04 g(201 mmol)的水(26 mL)溶液，滴畢(約1 h)，于室溫反應過夜。抽濾，濾液用氯仿(4×50 mL)萃取，合并萃取液，用無水MgSO4干燥，旋蒸濃縮后用正己烷(8×30 mL)加熱回流萃取，合并萃取液，減壓濃縮得2a 5.83 g。

用類似方法合成2b～2c。

2a: 黃色固體，收率80%;1H NMRδ: 3.73(s, 3H), 6.71(d,J=9.5 Hz, 1H), 7.23(dd,J=7.1 Hz, 7.2 Hz, 1H), 7.37(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.56(d,J=7.1 Hz, 1H), 7.58(dd,J=7.2 Hz, 8.9 Hz, 1H), 7.67(d,J=9.5 Hz, 1H);13C NMRδ: 30.4, 115.6, 120.4, 121.8, 124.2, 128.1, 128.8, 137.8, 139.5, 162.5。

2b： 亮黃色固體，收率84%;1H NMRδ: 2.38(s, 3H), 3.60(s, 3H), 6.59(d,J=9.6 Hz, 1H), 7.43(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.46(dd,J=8.4 Hz, 1.6 Hz, 1H), 7.51(brs, 1H), 7.83(d,J=9.6 Hz, 1H);13C NMRδ: 20.0, 28.9, 114.5, 120.0, 121.0, 128.3, 130.9, 131.8, 137.8, 138.9, 161.0。

2c： 黃色固體，收率85%;1H NMRδ: 2.71(s, 3H), 3.74(s, 3H), 6.57(d,J=9.2 Hz, 1H), 7.15(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.40(dd,J=7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.52(dd,J=7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.83(d,J=9.2 Hz, 1H);13C NMRδ: 23.4, 35.6, 120.4, 121.8, 122.3, 125.0, 127.3, 135.1, 140.0, 140.7, 163.1。

(2) 3a～3g的合成(以3a為例)

在反應瓶中加入發煙硝酸12 mL(290 mmol)，冰浴冷卻，攪拌下緩慢加入2a 1.7 g(10.5 mmol)，加畢，回流(120 ℃)反應7 h。冷卻至室溫，加水100 mL，抽濾，濾餅用乙腈重結晶得黃色針狀晶體3a 2.00 g。

用類似方法合成3b～3g。

3a： 黃色固體，收率65%;1H NMRδ: 3.43(s, 3H), 9.08(d,J=2.8 Hz, 1H), 9.25(d,J=2.8 Hz, 1H), 9.28(s, 1H);13C NMRδ: 35.2, 120.2, 124.8, 130.5, 136.3, 137.6, 138.5, 140.9(2C), 154.4。

3b： 黃色固體，收率16%, m.p.189～191 ℃;1H NMRδ: 2.42(s, 3H), 3.40(s, 3H), 8.55(s, 1H), 8.69(s, 1H);13C NMRδ: 16.0, 35.3, 112.3, 125.2, 128.1, 132.8, 132.8, 139.6, 142.5, 149.9, 153.8; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H8N4O7[M+]308.039 3, found 308.039 3。

3c： 黃色固體，收率21%, m.p.112～115 ℃;1H NMRδ: 2.37(s, 3H), 3.33(s, 3H), 6.92(d,J=10.0 Hz, 1H), 7.74(d,J=10.0 Hz, 1H), 8.32(s, 1H);13CNMRδ: 15.6, 34.0, 114.6, 123.2, 125.3, 129.7, 131.8, 132.3, 139.3, 149.2, 160.8; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H9N3O5[M+]263.054 2, found 263.054 2。

3d： 黃色針狀固體，收率45%, m.p.259～261 ℃;1H NMR(CD3CN)δ: 2.44(s, 3H), 3.77(s, 3H), 7.72(d,J=9.2 Hz, 1H), 7.81(d,J=9.2 Hz, 1H), 8.31(s, 1H);13C NMRδ: 16.4, 30.9, 108.7, 118.7, 124.8, 128.3, 136.5, 139.2, 142.1, 148.2, 152.9; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H9N3O5[M+] 263.054 2, found 263.053 7。

3e： 黃色固體，收率27%, m.p.188～190 ℃;1H NMRδ: 2.85(s, 3H), 3.82(s, 3H), 8.53(s, 1H), 8.60(s, 1H);13C NMRδ: 23.2, 37.7, 111.0, 127.9, 131.3, 131.6, 133.2, 140.7, 142.8, 145.9, 154.9; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H8N4O7[M+]308.039 3, found 308.039 5。

3f： 黃色固體，收率40%, m.p.216～219 ℃;1H NMRδ: 2.84(s, 3H), 3.78(s, 3H), 6.92(d,J=9.6 Hz, 1H), 7.66(d,J=9.6 Hz, 1H), 8.39(s, 1H);13C NMRδ: 23.4, 36.4, 113.2, 125.6, 129.5, 129.9, 131.8, 131.8, 140.0, 146.0, 162.1; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H9N3O5[M+]263.054 2, found 263.054 1。

3g： 黃色固體，收率28%, m.p.236～238 ℃;1H NMRδ: 2.84(s, 3H), 3.85(s, 3H), 8.42(d,J=2.8 Hz, 1H), 8.80(d,J=2.8 Hz, 1H), 9.09(s, 1H);13C NMRδ: 23.2, 37.0, 118.4, 125.2, 128.4, 131.1, 136.7, 140.3, 142.0, 146.0, 155.4; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H9N3O5[M+]263.054 2, found 263.054 1。

(3) 4a, 4e～4g的合成(以4a為例)

在反應瓶中加入3a 147 mg(0.5 mmol)和乙腈20 mL，攪拌下緩慢加入氰化鉀33 mg(0.5 mmol),加畢，于60 ℃反應2 h；冷卻至室溫，減壓濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑：V(正己烷) ∶V(乙酸乙酯)=7 ∶3]純化得4a 87 mg。

用類似方法合成4e～4g。

4a： 黃色粉末，收率63%; m.p.168～171 ℃;1H NMRδ: 3.37(s, 3H), 7.89(s, 1H), 8.70(d,J=2.6 Hz, 1H), 9.07(d,J=2.6 Hz, 1H);13C NMRδ: 34.8, 113.6, 119.4, 121.7, 123.6, 124.7, 132.3, 137.2, 138.7, 140.5, 160.1; IRν: 2 247 cm-1; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C11H6N4O5[M+]274.033 8, found 274.033 7。

4e： 紅色固體，收率83%; m.p.221～223 ℃;1H NMRδ: 2.78(s, 3H), 3.69(s, 3H), 7.86(s, 1H), 8.50(s, 1H);13C NMRδ: 23.2, 38.1, 108.3, 112.0, 115.6, 130.7, 131.0, 133.6, 136.4, 138.3, 146.8, 160.1; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C12H8N4O5[M+]288.049 5, found 288.049 4。

4f： 黃色固體，收率47%, m.p. 215～217 ℃;1H NMRδ: 2.86(s, 3H), 3.77(s, 3H), 7.02(d,J=9.6 Hz, 1H), 8.17(d,J=9.6 Hz, 1H), 8.42(s, 1H);13C NMRδ: 23.7, 36.4, 113.4, 119.2, 123.0, 125.4, 129.2, 129.7, 132.3, 135.6, 145.1, 162.3; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C12H9N3O3[M+]243.064 4, found 243.063 9。

4g： 棕色固體，收率90%， m.p.197～198 ℃;1H NMRδ: 2.84(s, 3H), 3.79(s, 3H), 7.66(s, 1H), 8.39(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.41(d,J=2.4 Hz, 1H);13C NMRδ: 23.3, 36.8, 114.3, 117.8, 119.4, 122.0, 128.8, 129.8, 130.7, 141.6, 145.2, 161.2; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C12H9N3O3[M+]243.064 4, found 243.063 7。

1.3抗腫瘤活性測定

取對數生長期的細胞株,加入胰酶，消化后，用含10%小牛血清的RMPI-1640培養基配制為單個細胞懸液(5×104個·mL-1)并接種于96孔培養板(每孔100 μL)[20]。置于37 ℃, 5%CO2培養箱中培養12 h。實驗組分別加入用DMSO溶解，培養液稀釋的不同濃度(20.00， 10.00， 5.00， 2.50， 1.25 μg·mL-1)的各化合物溶液。每組都各設3個平行孔，同時設對照組和空白組。相同條件下培養24 h。每孔中加入10 μL MTT(5 mg·mL-1磷酸緩沖鹽溶液)，繼續溫育4 h，吸去各孔內上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀在490 nm處測定各孔OD值[21]。實驗重復3次，計算一定濃度下化合物對細胞的抑制率，并按下式計算各化合物的IC50值。

2結果與討論

2.1合成

以喹啉系列物為反應起始物，經甲基化、氧化、硝化和cine-substitution反應合成了一系列1-官能化-4-氰化-2-喹諾酮類衍生物。實驗結果表明：當1-位和8-位存在雙取代時，2-喹諾酮吡啶環的4-位上可引入多種親核基團，從而制得一系列4-位官能化的2-喹諾酮類衍生物，為篩選具有生理活性的化學藥物提供來源。

2.2抗腫瘤活性

化合物對六種腫瘤細胞體外抑制活性的結果見表1。由表1可見：2c， 3d， 4g對六種腫瘤細胞的增值并沒有抑制作用；硝化產物3a～3c， 3e～3g對受試細胞則表現出了較好的抑制作用。而且三硝基取代的3a， 3b， 3e總體比二硝基取代的3c， 3f， 3g的抗腫瘤活性較好。其中1,8-二甲基-3,5,7-三硝基-2-喹諾酮(3e)對A549的抑制活性最高，IC50為2.05μmol·L-1。 4-位氰基化產物1-甲基-6,8-二硝基-4-氰基-2-喹諾酮(4a)選擇性的抑制A549和CT-26腫瘤細胞，IC50分別為9.34μmol·L-1和18.43μmol·L-1。

表1　化合物的抗腫瘤活性

以喹啉類化合物為原料，合成了系列1-官能化-4-氰化-2-喹諾酮類衍生物。

初步的體外抗腫瘤活性實驗結果表明：1-甲基-6,8-二硝基-4-氰基-2-喹諾酮(4a)對不同來源腫瘤細胞的敏感性存在差異，對A549和CT-26腫瘤細胞具有相對較高的選擇性。硝基產物的抗腫瘤活性較好，且化合物的硝基取代越多其抗腫瘤活性越好,說明硝基可能是其抗腫瘤活性的關鍵基團。1,8-二甲基-3,5,7-三硝基-2-喹諾酮(3e)對A549的抑制作用較好，其IC50(2.05μmol·L-1)較小，預示著該化合物具有潛在的抗腫瘤應用價值。有關其毒性及抗腫瘤作用的機制等有待進一步研究和探討。

參考文獻

[1]KumarA,FernandesJ,KumarP.SynthesisandbiologicalevaluationofsomenovelSchiffbasesof2-quinolones[J].InternationalJournalofPharmacyandPharmaceuticalSciences,2014,6(8):518-521.

[2]左信麗. 吳茱萸中生物堿類成分的研究進展[J].中國現代藥物應用,2015,09:265-267.

[3]SongWW,ZengGZ,PengWW, et al.CytotoxicamidesandquinolonesfromClausea Lansium[J].HelveticaChimicaActa,2014,97(2):298-305.

[4]湯俊,朱衛,屠治本. 蜆殼花椒化學成分的研究[J].中草藥,1995,11(23):563-565.

[5]劉方洲,張莉蓉,何美霞. 野花椒總生物堿和加錫果寧腦保護作用的實驗研究[J].中藥藥理與臨床,1998,04:12-14.

[6]ChenIS,WuSJ,TsaiIL, et al.ChemicalandbioactiveconstituentsfromZanthoxylum Simulans[J].Journalofnaturalproducts,1994,57(9):1206-1211.

[7]ChenIS,WuSJ,LeuYL, et al.AlkaloidsfromrootbarkofZanthoxylum simulans[J].Phytochemistry,1996,42(1):217-219.

[8]ChenIS,TsaiIW,TengCM, et al.PyranoquinolinealkaloidsfromZanthoxylum simulans[J].Phytochemistry,1997,46(3):525-529.

[9]胡喬銘. 單面針鎮痛物質基礎的研究及清除自由基活性評價[D].長沙:湖南中醫藥大學,2015.

[10]BylerKG,WangC,SetzerWN.Quinolinealkaloidsasintercalativetopoisomeraseinhibitors[J].Journalofmolecularmodeling,2009,15(12):1417-1426.

[11]KamikawaT,HanaokaY,FujieS, et al.SRS-AantagonistpyranoquinolonealkaloidsfromEastAfricanFagaraplantsandtheirsynthesis[J].Bioorganic&medicinalchemistry,1996,4(8):1317-1320.

[12]SeyaK,MikiI,MurataK, et al.Pharmacologicalpropertiesofpteleprenine,aquinolinalkaloidextractedfromOrixa japonica,onguinea-pigileumandcanineleftatrium[J].Journalofpharmacyandpharmacology,1998,50(7):803-807.

[13]MurrayJK,BalanC,AllgeierAM, et al.Dipeptidyl-quinolonederivativesinhibithypoxiainduciblefactor-1αprolylhydroxylases-1,-2,and-3withalteredselectivity[J].Journalofcombinatorialchemistry,2010,12(5):676-686.

[14]AudisioD,MessaoudiS,CojeanS, et al.Synthesisandantikinetoplastidactivitiesof3-substitutedquinolinonesderivatives[J].Europeanjournalofmedicinalchemistry,2012,52:44-50.

[15]PatelD,KumariP,PatelN.Synthesisandbiologicalevaluationofsomethiazolidinonesasantimicrobialagents[J].Europeanjournalofmedicinalchemistry,2012,48:354-362.

[16]SubashiniR,KhanFRN.Solvent-freesynthesisandantibacterialstudiesofsomequinolinones[J].MonatsheftefürChemie-ChemicalMonthly,2012,143(3):485-489.

[17]TaniM,GyobuY,SasakiT, et al.SF2809compounds,novelchymaseinhibitorsfromDactylosporangiumsp.1.Taxonomy,fermentation,isolationandbiologicalproperties[J].TheJournalofantibiotics,2004,57(2):83-88.

[18]IkumaY,HochigaiH,KimuraH, et al.Discoveryof3H-imidazo[4,5-c]quinolin-4(5H)-onesaspotentandselectivedipeptidylpeptidaseIV(DPP-4)inhibitors[J].Bioorganic&medicinalchemistry,2012,20(19):5864-5883.

[19]ChenX,KobiroK,AsaharaH, et al.Reactive2-quinolonesdearomatizedbystericrepulsionbetween1-methyland8-substitutedgroups[J].Tetrahedron,2013,69(23):4624-4630.

[20]湯為學,駱云鵬,王瑞雪. 人實體瘤抗癌藥物敏感試驗MTT法的建立[J].重慶醫科大學學報,1992,02:103-108.

[21]王娟娟,賈山嶺,萬新軍,等.MTT法測定棉酚對多浪羊淋巴細胞生長的影響[J].湖北農業科學,2013,05:1098-1101.

收稿日期：2016-05-03

基金項目：湖北中醫藥大學科研啟動基金項目(000913)； 青苗計劃(5112-0007)

作者簡介：陳春雪(1992-)，女，漢族，湖北隨州人，碩士研究生，主要從事天然活性產物的化學合成與結構修飾研究。 E-mail: 1575964321@qq.com 通信聯系人： 陳新，助理研究員， E-mail: chenxin30172@hotmail.com

中圖分類號：O625.42

文獻標志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.07.16118

Synthesis and Antitumor Activities of 1-Methy-2-quinolone Derivatives

CHEN Chun-xue,YOU Peng-tao,LIU Yan-wen,CHEN Xin*

(Resource and Chemistry of Chinese Medicine Hubei Provincial Key Laboratory,Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)

Abstract：Three 2-quinolones(2a～2c) were synthesized by methylation and oxidation under basic condition from quinolines. Seven nitro-2-quinolones(3a～3g) were obtained by nitration of 2a～2c. Finally, four 1-methyl-4-cyanide-2-quinolones(4a, 4e～4g) were synthesized by cine-substitution reaction of 3a, 3e～3g with potassuim cyanide. The structures were confirmed by1H NMR,13C NMR and HR-MS(EI). The antitumor activities of the compounds were investigated by MTT assay against MCF-7, H1299, A549, PC-12, CT-26 and HepG-2. The results showed that some of compounds exhibited better inhibition activities than quinolines. 1,8-Dimethyl-3,5,7-trinitroquinolin-2(1H)-one(3e) exhibited good inhibition activities against the six cancer cell lines, especially A549 cell with IC50of 2.05 μmol·L-1. 1-Methyl-6,8-dinitro-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-4-carbonitrile(4a) showed better inhibition activities against A549 and CT-26 with IC50of 9.34 μmol·L-1and 18.43 μmol·L-1, respectively.

Keywords：quinoline; 2-quinolone derivative; cine-substition; synthesis; antitumor activity