除蟲脲亞慢性染毒對大鼠血液系統的影響

胡雄飛, 陸　丹, 熊志軍, 張麗娜

(湖南省職業病防治院毒理室，長沙　410007)

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除蟲脲亞慢性染毒對大鼠血液系統的影響

胡雄飛, 陸丹, 熊志軍, 張麗娜

(湖南省職業病防治院毒理室，長沙410007)

目的在研究除蟲脲對大鼠的亞慢性經口毒性基礎上，初步探討染毒后對大鼠血液系統的影響。 方法將80只SPF級SD大鼠按體重隨機分成4組，每組20只，雌雄各半。分別用含0、25、500、10000 mg/kg 除蟲脲的飼料連續喂飼染毒3個月，觀察各組大鼠的臨床表現、攝食量、體重，實驗結束時測定相關血液學指標、血液生化學指標、臟器重量、臟器系數及病理組織學改變。 結果實驗期間，各劑量組雌、雄鼠進食、活動、飲水基本正常，未見明顯中毒表現。中、高劑量組大鼠血液紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)和紅細胞壓積(HCT)降低，高劑量組大鼠血液平均紅細胞體積(MCV)和紅細胞分布寬度(RDW)升高，并且雄鼠血清總膽紅素(TBIL)升高，與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.01或0.05)。高劑量組大鼠脾臟重量和臟器系數均增高，雌鼠肝臟重量和臟器系數均增高，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。高劑量組全部動物及中劑量組部分動物脾臟明顯腫大，質地較硬，顏色較深。病理檢查結果顯示其脾臟紅髓髓竇高度擴張并充滿大量紅細胞,髓質內含鐵血黃素沉積明顯。 結論除蟲脲對大鼠血液系統有明顯損害，長期接觸可能會導致脾臟腫大、機體出現慢性溶血性貧血表現。

除蟲脲；亞慢性毒性；血液系統；慢性溶血性貧血

除蟲脲是20世紀70年代發現的苯甲酸基苯基脲類除蟲劑，是一類能抑制靶標害蟲的幾丁質合成而導致其死亡或不育的昆蟲生長調節劑(IGRs)，被譽為第三代殺蟲劑或新型昆蟲控制劑。由于缺乏幾丁質，幼蟲不能形成新表皮、化蛹受阻，成蟲難以羽化、產卵以及蟲卵不能正常發育，所以除蟲脲的殺蟲優勢在于影響害蟲的整個世代。因其獨特的作用機制、較高的環境安全性以及廣譜高效的殺蟲活性而被廣泛使用，國內外已有14家企業對其進行產品登記[1]。但目前對其毒理學研究的報道甚少，特別是亞慢性毒性研究，國內未見相關報道。本研究對除蟲脲原藥進行了亞慢性經口毒性試驗，探討其對大鼠血液系統的影響，為全面評價其毒性及作用機制提供科學依據。

1　材料和方法

1.1主要試劑

除蟲脲(98%)，類白色粉末，由國內某農用激素研究中心提供。

1.2動物與分組

選用湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供的SPF級健康SD大鼠【SCXK(湘)2011-0003】，4～6周齡，體重90～108 g。將80只動物按體重隨機分成4組，每組雌雄各10只。設低、中、高三個劑量組和一個對照組。動物單籠喂養，自由進食和飲用純凈水。實驗動物使用許可證號為【SYXK(湘)2014-0003】。

1.3染毒方法與劑量

根據除蟲脲對SD大鼠相關毒性資料[2]，本次實驗雌、雄鼠各組設計劑量均為2.5、50、1000 mg/kg bw·d。按大鼠進食量為其體重的10%比例將受試物直接混入飼料，分別用含25、500、10000 mg/kg 除蟲脲的飼料連續喂飼染毒3個月。對照組給予不加藥的清潔級基礎飼料。

1.4觀察及檢測指標

(1)動物的一般狀況、每周體重及攝食量變化。(2)染毒結束時取靜脈血，BC-5300Vet全自動血液細胞分析儀和BACKMAN COULTER全自動生化分析儀分別測定血液學指標和血液生化學指標。(3)試驗結束時處死動物，小心分離肝、脾、腎，對其稱重并計算臟器系數。(4)將分離出的所有器官和組織用福爾馬林固定，進行石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下病理組織學檢查。

1.5統計學分析

采用SPSS統計軟件(V11.5)對各項檢測數據作單因素方差分析或t檢驗。以評定各劑量組與對照組之間是否有明顯差異。檢驗水準為α=0.05。

2　結果

2.1動物的一般狀況

各劑量組雌、雄鼠在整個染毒期間攝食、活動、飲水基本正常，未見明顯中毒表現。染毒期間各劑量組雌、雄鼠體重及攝食量較對照組無明顯變化(表1)。

2.2染毒劑量

根據各組雌、雄大鼠試驗期間攝食量計算得出各組實際染毒劑量：雌性大鼠分別為0，1.7，36.0和736.0 mg/kg，雄性大鼠分別為0，1.6，32.6和658.0 mg/kg。

2.3血液學及血生化指標

中、高劑量組大鼠血液紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)和紅細胞壓積(HCT)降低，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05和0.01)，并且隨著染毒劑量的增加而不斷下降；高劑量組大鼠血液平均紅細胞體積(MCV)和紅細胞分布寬度(RDW)升高，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。高劑量組雄鼠血清總膽紅素(TBIL)明顯升高，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著染毒劑量的增加而不斷升高。各劑量組血小板計數(PLT)與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

2.4白細胞及分類

各劑量組雌、雄鼠白細胞計數(WBC)與對照組比較無顯著變化。中劑量組雄鼠中性粒細胞比例(Neu)明顯高于對照組、淋巴細胞比例(Lym)明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05和0.01)，但均無劑量反應關系。各劑量組單核細胞(MON)和嗜酸性粒細胞比例與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。

2.5臟器重量及臟器系數

高劑量組雌、雄鼠脾臟重量和臟器系數均增高，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，且隨著染毒劑量的增加而不斷升高。高劑量組雌鼠肝臟重量和臟器系數均增高，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)。各劑量組大鼠其余臟器重量及臟器系數均無明顯異常(表4)。

2.6病理組織學檢查

大體解剖發現，高劑量組全部雌、雄鼠及中劑量組6只雌鼠、4只雄鼠脾臟明顯腫大，質地較硬，顏色較深。普通光學顯微鏡下可見脾臟紅髓髓竇高度擴張并充滿大量紅細胞,髓質內含鐵血黃素沉積明顯。其它主要臟器未見明顯病理學改變(圖1)。

劑量組(Group)染毒前(g)(Beforeadministration)第1個月(g)(Thefirstmonth)第2個月(g)(Thesecondmonth)第3個月(g)(Thethirdmonth)對照組(Controlgroup)♀♂95.7±4.3100.1±4.1210.5±9.7313.3±22.6262.1±19.9415.0±38.6288.1±25.7444.8±54.6低劑量組(Low-dosegroup)♀♂95.4±3.3100.0±3.4208.8±14.8301.2±21.8260.6±21.7422.9±33.5280.1±32.8454.9±27.3中劑量組(Moderate-dosegroup)♀♂95.5±4.0100.2±4.3206.8±22.3293.7±24.6264.2±16.7416.5±31.6284.6±27.2471.9±55.2高劑量組(High-dosegroup)♀♂94.9±3.299.7±3.4207.6±29.5299.4±16.7274.7±21.5415.8±44.4310.1±14.4441.0±91.8

劑量組(Group)RBC(×1012/L)HGB(g/L)HCT(%)MCV(fL)RDW(%)PLT(×109/L)TBIL(μmol/L)對照組(Controlgroup)♀♂8.08±0.229.32±0.60167±4177±1046.2±1.349.1±2.957.1±1.152.7±1.412.3±0.813.2±0.4455±411395±2425.86±1.916.15±2.09低劑量組(Low-dosegroup)♀♂7.95±0.519.08±0.51163±7176±445.2±2.648.6±1.857.0±1.353.6±1.912.6±0.513.0±0.9393±345368±2545.80±2.347.24±3.08中劑量組(Moderate-dosegroup)♀♂7.06±0.54**8.68±0.27*152±6**169±7*42.2±2.0**46.9±2.2*59.9±3.454.0±2.012.9±1.813.6±0.6511±295329±2266.49±4.607.96±5.13高劑量組(High-dosegroup)♀♂6.54±0.40**7.53±0.29**148±6**157±4**42.1±2.1**45.0±1.6**64.5±4.8**59.9±3.0**13.8±0.8**14.7±1.1**404±367272±2635.76±1.2012.28±10.17*

注：與對照組比較，*與對照組比較P<0.05，**與對照組比較P<0.01。

Note: Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

劑量組(Group)WBC(×109/L)白細胞分類(%)LeukocytedifferentialcountNEULYMMONEOS對照組(Controlgroup)♀♂7.08±1.4213.41±3.2221.5±5.916.2±5.966.3±9.973.9±8.24.0±1.94.2±2.08.1±5.65.1±2.4低劑量組(Low-dosegroup)♀♂8.13±1.7814.90±4.3422.5±7.722.6±7.966.3±9.266.2±9.33.6±1.43.8±1.87.3±3.36.6±3.7中劑量組(Moderate-dosegroup)♀♂8.27±1.7613.46±3.1423.8±6.424.7±5.5*63.9±10.262.2±9.0**3.8±1.54.3±1.38.1±4.68.2±3.9高劑量組(High-dosegroup)♀♂10.09±6.1615.67±6.2618.0±8.419.4±3.365.9±7.869.4±4.96.1±5.43.8±2.99.6±5.26.4±4.1

注：與對照組比較，*與對照組比較P<0.05，**與對照組比較P<0.01。

Note: Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

劑量組(Group)肝(g)Liver(g)脾(g)Spleen(g)腎(g)Kidney(g)肝/體(%)Livercoeffcient脾/體(%)Spleencoeffcient腎/體(%)Kidneycoeffcient對照組(Controlgroup)♀♂6.47±0.509.35±1.210.46±0.080.64±0.131.74±0.142.77±0.362.40±0.142.19±0.120.17±0.020.15±0.020.65±0.050.65±0.07低劑量組(Low-dosegroup)♀♂6.53±0.5410.07±1.780.44±0.050.63±0.111.69±0.212.86±0.262.53±0.212.37±0.350.17±0.030.15±0.030.65±0.070.67±0.04中劑量組(Moderate-dosegroup)♀♂6.75±0.7210.58±1.270.59±0.110.75±0.151.69±0.122.97±0.392.55±0.262.40±0.110.22±0.05*0.17±0.020.64±0.050.67±0.06高劑量組(High-dosegroup)♀♂7.81±0.82**10.76±0.890.88±0.22**1.14±0.26**1.84±0.062.84±0.492.68±0.20**2.44±0.160.30±0.06**0.26±0.06**0.63±0.040.65±0.12

注：與對照組比較，*與對照組比較P<0.05，**與對照組比較P<0.01。

Note: Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

注：1. 對照組大鼠脾臟組織切片；2. 高劑量組大鼠脾臟組織切片；箭頭所指為含鐵血黃素。圖1　病理組織學檢查(HE×40)Note：1. The histological section of spleen from the rat of the control group；2. The histological section of spleen from the rat of the high dose group. The arrow point out haemosiderin.Fig.1　Pathology pictures(HE×40)

3　討論

體重是動物實驗中一個重要的非特異性指標，可綜合反映動物機體中毒效應，也可反映外來化合物對機體的綜合影響[3-4]。本次研究結果顯示，各劑量組大鼠體重差異無統計學意義，表明在本實驗條件下，除蟲脲對大鼠體重增長、發育均未發生明顯影響。

流行病學調查研究顯示[5]，多種農藥(包括有機磷農藥、有機氯農藥、合成除蟲菊酯、氨基甲酸酯等)暴露的易感性和高暴露水平等，會使兒童患血液病的發病風險增大。我們在實驗中發現，除蟲脲作為苯甲酸基苯基脲類除蟲劑，中、高劑量組大鼠血液RBC、HGB和HCT均降低，表明大鼠已出現貧血。紅細胞形成過程中，晚幼紅細胞脫核釋放入外周血后，變成含有RNA和少量DNA碎片的網織紅細胞(reticulocytes，Ret)，這種細胞在血管內進一步成熟，24 ～ 36 h后變成成熟紅細胞[6]。溶血性貧血(hemolytic anemia，HA)是指紅細胞破壞速率增加(壽命縮短)，并且超過骨髓造血的代償能力而發生的一類貧血。根據HA診斷依據[7]，HA不僅出現血液RBC、HGB和HCT降低，一般還會伴有Ret和TBIL的升高。本次研究中高劑量組雄鼠血清TBIL明顯升高，血液WBC及其分類無明顯變化，符合HA特征。國外曾有報道，13周持續染毒除蟲脲后大鼠外周血紅細胞計數下降、網織紅細胞明顯上升，可以作為佐證。血液MCV和RDW對不同貧血的鑒別診斷有重要參考價值。有報道顯示[8]，溶血性貧血(HA)患者MCV與RDW均升高，屬大細胞性貧血。本次實驗結果顯示高劑量組大鼠血液MCV與RDW均明顯高于對照組，考慮該貧血可能為HA。

造成紅細胞破壞過多的因素分為內在和外在兩部分，內在因素主要為紅細胞先天性缺陷，外在因素中很多種類，其中很重要一種就是接觸藥物[9-11]及化學品所致的溶血性貧血。可引起溶血性貧血的化學物質主要有氧化劑類，如芳香族有機物、氧原子以及有氧化作用的銅、砷、鉛等[12]。除蟲脲從結構上看屬于芳香族有機物，為外來化學物致HA的敏感物質。慢性HA臨床表現一般為貧血、黃疸和脾大。我們也在試驗中發現，高劑量組雌、雄鼠脾臟重量和脾臟臟器系數均明顯增高，其脾臟重量均接近于對照組2倍。可以推測大鼠由于長期一定劑量攝入除蟲脲，導致機體血液紅細胞被快速破壞，當紅細胞破壞的速度超過了骨髓造血的代償能力，致使脾臟恢復造血功能，進一步導致增生性脾大。大體解剖發現，高劑量組全部大鼠及中劑量組部分大鼠脾臟明顯腫大，質地較硬，顏色較深。病理檢查結果顯示其脾臟紅髓髓竇高度擴張并充滿大量紅細胞,髓質內含鐵血黃素沉積明顯。本次研究可見，除蟲脲對大鼠血液系統可造成明顯損害。

[1]劉剛.除蟲脲原藥產品登記企業達到14家.農化市場十日訊,2013,(19);38-38.

[2]Cornell University. Pesticide Management Education Program PMEP[DB/OL].http://pmep.cce.cornell.edu/profiles/extoxnet/dienochlor-glyphosate/diflubenzuron-ext.html, 1993-9.

[3]劉英華，張靜姝，邸金茹，等. 三聚氰胺對大鼠的亞慢性毒性研究[J]. 環境與健康雜志,2010,27(5):422-425.

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[8]盧煥興，余艷云.血液細胞學參數在貧血診斷中的應用[J]. 現代預防醫學,2005,32(6):698-700.

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[12]付蓉. 后天獲得性溶血性貧血[J]. 中國實用內科雜志,2009,(7);596-599.

Blood toxicity assessment of subchronic exposure to diflubenzuron in SD rats

HU Xiong-fei, LU Dan, XIONG Zhi-jun, ZHANG Li-na

(Hunan Prevention and Treatment Institute of Occupational Diseases, Changsha, 410007, China)

ObjectiveTo investigate the effects of diflubenzuron on the blood system in rats. MethodsA total of 80 rats were randomly divided into three diflubenzuron treated groups and one negative control group. Different doses of diflubenzuron at 0, 25, 500 and 10000 mg/kg were administered continuously for 90 days to the rats by the way of feeding. Animals were observed for clinical signs of toxicity, food consumption and body weight. Haematological parameters, clinical chemistry parameters, absolute and relative organ weights and histopathological changes were examined at the end of the study. ResultDuring the period of the study, the food and water consumption were all normal at all dose groups and no obvious toxicity symptoms appeared. For haematological parameters, the main changes were the decrease of red blood cell count(RBC), haemoglobin(HGB) and haematocrit(HCT) in the medium and high dose groups and the increase of mean corpuscular volume(MCV) and erythrocyte hemoglobin distribution width(RDW) in the high dose group(P<0.05 or 0.01). For clinical chemistry parameters, the main change was the increase of total bilirubin(TBIL) in the high dose group of male rats(P<0.05). The absolute and relative spleen weights increased obviously in the female and male rats of the high dose group(P<0.01). The absolute and relative liver weights increased obviously in the female rats of the high dose group(P<0.01). The spleens were larger, harder and darker than normal in all of the rats of high dose group and part of the rats of medium dose group. For the result of histopathology examination of spleen, the main changes were a lot of red cells in the medullary sinus and haemosiderin in the medulla. Conclusion Diflubenzuron had toxic effect on the blood system of the rats. The spleen was intumesce and chronic hemolytic anemia may be occurred for long-term exposure.

Diflubenzuron; Subchronic toxicity; Blood system; Chronic hemolytic anemia

胡雄飛(1983-)，男，主管醫師，碩士生，從事毒理學研究。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0077-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.012

2016-02-01