丹寧酸交聯后續處理對牛頸靜脈血管的影響

孫嘉康，周建業，唐　躍，羅富良，汪　勝，周慶亮，霍美俊

(1.北京協和醫學院 中國醫學科學院 阜外醫院 國家心血管病中心 心血管疾病國家重點實驗室，北京　100037；2.北京邁迪頂峰醫療科技有限公司，北京　101312)

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丹寧酸交聯后續處理對牛頸靜脈血管的影響

孫嘉康1，周建業1，唐躍1，羅富良1，汪勝1，周慶亮2，霍美俊2

(1.北京協和醫學院 中國醫學科學院 阜外醫院 國家心血管病中心 心血管疾病國家重點實驗室，北京100037；2.北京邁迪頂峰醫療科技有限公司，北京101312)

目的觀察丹寧酸固定后續處理對改善丹寧酸交聯牛頸靜脈貯存液穩定性，和對血管熱穩定性、抗鈣化能力、生物力學性能及纖維結構的影響。方法新鮮牛頸靜脈分別經戊二醛固定(戊二醛組)、丹寧酸交聯(丹寧酸組)及丹寧酸交聯后續處理(實驗組)，采用大鼠皮下植入模型測定鈣含量、熱皺縮溫度、斷裂強度和斷裂伸長率、以及組織病理學檢查等指標進行評價。結果研究組所有指標均優于戊二醛組(P<0.05)；與丹寧酸組比較，實驗組的貯存液顏色不再變化，熱皺縮溫度有所降低，21 d鈣含量略升、60 d鈣含量略低(P<0.01)，兩組材料力學強度結果無統計學差異(P>0.05)，且兩組的膠原纖維和彈力纖維均保持較好的完整性。結論丹寧酸交聯后處理可提高貯存液的穩定性，使牛頸靜脈血管的柔軟性有所恢復，同時保持了血管抗鈣化能力、組織強度和纖維結構的完整性。

牛頸靜脈；丹寧酸；鈣化；生物力學

牛頸靜脈帶瓣血管因其具有天然瓣膜結構、規格齊全、來源易得等優點，是良好的心血管外科修補材料[1]，但由于血管壁易發生嚴重鈣化而制約了牛頸靜脈血管的廣泛應用。本課題組前期的研究發現，在傳統戊二醛固定的基礎上增加丹寧酸序貫交聯可顯著提高牛頸靜脈血管的抗鈣化能力和其他理化性能[2]。但在隨后的研究中也發現，丹寧酸既能交聯彈力纖維，也能交聯膠原纖維，在增加組織強度的同時也帶來了血管變硬、順應性變差、手術操作性能下降的問題。此外，丹寧酸溶液是多元醇和多元酚的混合物，組成成分和化學反應復雜，容易發生自聚合反應，放置在丹寧酸溶液里的牛頸靜脈會持續變硬，溶液顏色也持續變深。因此，如何解決血管的血管順應性下降，和改善貯存液穩定性的問題，是本文的研究目標。本研究在丹寧酸序貫交聯的基礎上再增加漂洗及更換貯存液的后繼處理，并評價了該處理對牛頸靜脈血管抗鈣化性能、生物力學性能和纖維結構的影響。

1　材料和方法

1.1樣品采集及分組處理

取新鮮牛頸靜脈，去除血管表面脂肪，分為3組。戊二醛固定為對照組(戊二醛組): 用0.6%戊二醛于4℃固定2 d，再于0.3%戊二醛溶液中處理7 d以上，長期保存備用；丹寧酸交聯組(丹寧酸組)，在戊二醛固定組基礎上，用0.3%丹寧酸于4℃避光處理4 d以上，長期保存備用；丹寧酸后處理組(實驗組):丹寧酸交聯基礎上，用0.3%戊二醛溶液4℃振蕩漂洗10次，每次8 h，最后于0.3%戊二醛中保存備用。

1.2貯存液穩定性觀察

分別取丹寧酸組交聯完成后最小包裝一瓶(含一根牛頸靜脈血管和50 mL溶液)、實驗組處理完成后最小包裝一瓶，4℃避光保存30 d，取出靜脈血管，比較顏色改變情況。

1.3熱皺縮溫度測定

將5×40 mm長方形血管片掛于皮革溫度收縮測定儀測試架(MSW-YD4，陜西科技大學)的上、下掛鉤之間，以純化水作為加熱介質，測量待測樣品的熱皺縮溫度。

1.4周向斷裂拉伸力

在牛頸靜脈血管上避開瓣膜竇部分，取長度為30 mm±0.5 mm的血管為樣品，保持血管完整形態橫向固定于電子萬能材料試驗機(WDW-1，上海松頓機械設備有限公司)，設定拉伸速度100 mm/min，記錄血管斷裂時拉力及斷裂拉伸率。

1.5軸向拉伸斷裂力

取長度為50 mm±0.5 mm的血管為樣品，保持血管完整形態縱向固定于電子萬能材料試驗機(WDW-1，上海松頓機械設備有限公司)，夾具間距50 mm，拉伸速度100 mm/min，記錄血管斷裂時拉力及斷裂拉伸率。

1.6大鼠皮下植入模型的鈣含量測定

1.6.1大鼠皮下埋植模型

30只SPF級SD雄性大鼠，21 d(70～80 g)，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2015-0001】。無菌手術在中國醫學科學院阜外醫院屏障動物實驗設施進行【SYXK(京)2013-0025】。實驗動物使用經中國醫學科學院阜外醫院“實驗動物福利與倫理審查委員會”討論同意使用。

1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，SD大鼠俯臥位固定，背部正中切口，在皮下植入分別經過戊二醛組、丹寧酸組和實驗組的牛頸靜脈血管片各1片，隨后縫合皮膚切口，并消毒。每個植入片為1 cm×1 cm，植入前用無菌生理鹽水清洗3次，每次2 min，每次生理鹽水用量為500 mL。

術后大鼠隨機分為2組，分別于術后21 d和60 d采用吸入CO2的方法處死大鼠，取出植入血管片，去除表面的宿主組織，生理鹽水沖洗備用。

1.6.2鈣含量測定

將樣品經恒溫烘箱80℃干燥48 h至衡重，稱重并記錄，隨后用優級純HNO31 mL，低溫加熱至樣品溶解，并繼續加熱至溶液近干，用去離子水定容至20 mL 容量瓶中待測。檢測使用儀器為電感耦合等離子體光譜儀(icap 6300，Thermo)。用鈣標準儲備液(1000 μg，購于國家標準物質研究中心)繪制標準曲線。隨后將樣品注入檢測儀器，計算鈣含量。計算公式 元素含量(μg/g)=(A-A0)*V/m，其中A為樣品溶液中待測元素濃度值，單位μg/mL；A0為樣品空白溶液中待測元素濃度值，單位μg/mL；V為樣品定容體積，單位mL；m為樣品質量，單位g。

1.7組織病理學觀察

皮下植入后血管片標本石蠟包埋、切片、酒精梯度脫水后分別做Masson染色和ET+VG染色，蔡司光學顯微鏡下觀察照相。

1.8統計學分析

注：(A)為丹寧酸處理組；(B)為實驗組。圖1　貯存液顏色Note：(A) TA group;(B) Study group.Fig.1　Color of storage solution

2　結果

2.1貯存液變色情況

由圖1可見實驗組顏色保持不變，表明貯存液已趨于穩定。

2.2熱皺縮溫度

表1所示，實驗組熱皺縮溫度低于丹寧酸組，戊二醛組熱皺縮溫度最低，3組間差異具有顯著性(P<0.01)。說明后續處理會影響牛頸靜脈血管的熱穩定性，但仍優于戊二醛組。

表1　熱皺縮溫度

2.3周向/軸向拉伸斷裂力

根據表2所示結果，實驗組與戊二醛組比較，實驗組周向/軸向拉伸斷裂力均優于戊二醛組(P<0.05)；實驗組與丹寧酸組比較，周向/軸向拉伸斷裂力無差異(P>0.05)。

2.4大鼠皮下埋植血管片鈣含量

表3所示，實驗組、丹寧酸組鈣含量各時間點均優于戊二醛組(P<0.01)；與丹寧酸組比較，實驗組21d鈣含量略升、60d鈣含量略低(P<0.01)。

2.5組織病理學觀察

由圖2可見，實驗組與丹寧酸組比較，彈力纖維結構基本保持完整，未見明顯變化。圖中箭頭指處藍紫色為彈力纖維，戊二醛組的彈力纖維斷裂、排列雜亂，60 d組尤其明顯(B)；丹寧酸組和實驗組兩個時間點的彈力纖維的基本保存完好，明顯好于戊二醛組。提示后續的處理手段并未削弱丹寧酸對牛頸靜脈管壁膠原纖維與彈力纖維結構的穩定作用。

圖3中箭頭指處紅色為膠原纖維，3組在植入21 d時，膠原纖維基本保持原有結構；植入60 d時，戊二醛組膠原纖維斷裂(B)，而其他兩組膠原纖維仍保持較好的完整性。

表2　周向/軸向拉伸斷裂力

表3　大鼠皮下埋植血管片鈣含量

3　討論

人工帶瓣血管是肺動脈閉鎖、永存動脈干、大動脈轉位等外科矯治手術中重建右室流出道不可缺少的修補材料[3]。目前臨床中廣泛使用戊二醛固定的異種生物材料，雖然生物力學性能達到要求[4]，但遠期鈣化問題始終無法解決，這是以Contegra為代表的商業化牛頸靜脈帶瓣管道不能回避的待解問題[5]。因此，近年來學者們聚焦于新型交聯方法的探索，例如使用原花青素等改性方法，得到了比較滿意的結果[6-8]。

本課題組前期的研究證明，在戊二醛固定的牛頸靜脈帶瓣血管的基礎上再經過丹寧酸交聯處理，牛頸靜脈的生物力學強度及抗鈣化能力得到顯著改善[2]。這是由于戊二醛僅能交聯固定膠原纖維，而丹寧酸不僅能交聯膠原纖維，還能交聯彈力纖維[9-10]。在血管類富含彈力纖維的生物材料中，彈力纖維斷裂、衰敗引起的炎性反應和成骨過程，誘發了鈣結晶的形成[11-12]，是容易發生嚴重鈣化的主要原因，丹寧酸對彈力纖維的交聯作用，減少了彈力纖維斷裂的發生，從而減輕了牛頸靜脈的鈣化程度。

雖然丹寧酸序貫交聯使牛頸靜脈血管抗鈣化能力和力學強度得到顯著提高，但在進行大動物植入實驗時，發現經丹寧酸交聯后的血管較硬、順應性變差，手術操作性能下降；另外發現，丹寧酸交聯后，隨著保存時間延長血管材料持續變硬，同時貯存液顏色持續變深。雖然具體原因不明，但我們推測可能有兩個原因：一是交聯處理完成時組織中殘留有未反應的丹寧酸，二是丹寧酸成分復雜，在酸性環境下會持續發生自體聚合反應[13]，而且丹寧酸主要通過氫鍵與彈力纖維等結合[14-15]，鍵能較低，不夠穩定。因此，我們計劃采用多次漂洗的方法去除多余的丹寧酸，再將血管貯存到偏堿性的0.3%戊二醛溶液中，希望能遏制多余的聚合反應，保持貯存液的穩定性。

經過上述的后處理措施，可以直觀地觀察到貯存液顏色不再變深，表明貯存液趨于穩定。同時發現后處理組的血管變軟，血管順應性和大動物植入手術的操作性能提升明顯，雖然沒有合適的方法進行量化的測定，但血管材料變軟確實是客觀存在。這一現象也可以從熱皺縮溫度的降低得到證實，熱皺縮溫度反映組織材料中的鍵合程度，后處理步驟使熱皺縮溫度降低了2℃，表明血管組織中的鍵合程度有所降低，材料變軟有合理的解釋。

后續處理在改善了血管材料的柔順性的同時，保持了組織強度不減弱，無論是軸向還是周向的斷裂拉力和斷裂伸長率都沒有顯著變化。而對于丹寧酸處理帶來的優異的抗鈣化性能也得到了很好的保持，雖然丹寧酸組和實驗組鈣含量在統計學上表現為有差異，但相對于戊二醛50 mg/g和150 mg/g的量級而言，相差1 mg/g是沒有實際意義的，因此我們認為后處理步驟維持了丹寧酸的抗鈣化性能。病理學觀察也表明后處理并未破壞血管的彈力纖維和膠原纖維結構的完整性。

綜上所述，本研究通過對丹寧酸處理的牛頸靜脈帶瓣血管進行多次漂洗和更換貯存液的后處理，改善了貯存液穩定穩定性，提高了血管順應性和手術操作性能，同時保持了血管材料的抗鈣化性能、力學強度和纖維結構的完整性。而丹寧酸交聯反應和自體聚合的具體機制有待進一步深入研究。

注：(A)和(B)為戊二醛組，分別埋植21 d和60 d；(C)和(D)為丹寧酸組，分別埋植21 d和60 d；(E)和(F)為實驗組組，分別埋植21 d和60 d。圖2　牛頸靜脈植入大鼠皮下后血管片的彈力纖維情況(ET+VG染色，×20) Note：(A) 21-days’ Glut group (B) 60-days’ Glut group; (C) 21-days’ TA group (D) 60-days’TA group; (E) 21-days’ Study group (F) 60-days’Study group.Fig.2　Vascular elastic fiber after implanting BJVs subcutaneously into the rat (ET + VG,× 20)

注：(A)和(B)為戊二醛組，分別埋植21 d和60 d；(C)和(D)為丹寧酸組，分別埋植21 d和60 d；(E)和(F)為實驗組，分別埋植21 d和60 d。圖3　牛頸靜脈植入大鼠皮下后血管片的膠原纖維情況(Masson染色，×20)Note：(A) 21-days’ Glut group (B) 60-days’ Glut group; (C) 21-days’ TA group (D) 60-days’TA group;(E) 21-days’ Study group (F) 60-days’Study group.Fig.3　Vascular collagenous fiber after implanting BJVs subcutaneously into the rat (Masson,× 20)

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Effect of post-treatment on tannic acid fixed bovine jugular vein

SUN Jia-kang1, ZHOU Jian-ye1, TANG Yue1, LUO Fu-liang1, WANG Sheng1,ZHOU Qing-liang2, HUO Mei-jun2

(1.State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 10037, China;2. Beijing Med Zenith Medical Scientific Co..Ltd, Beijing 101312, China)

ObjectiveTo investigate effects of post-treatment on stability of storage solution/ thermostability， anti-calcification, the biomechanics and fibred structures of tannic acid fixed bovine jugular vein(BJV). Methods Fresh bovine jugular vein were treated with glutaraldehyde (Glut group), tannic acid (TA group), and post-treatment on TA-fixed (Study group). Calcium level was measured by implanting BJVs subcutaneously into the rats. The shrinkage temperature, tensile strength，elongation at break and histological changes were evaluated as well. Results Compared with Glut group，all results were better in Study group (P<0.05). Compared with TA group, in the Study group, color of storage solution did not change, shrinkage temperature and 60-days’ calcium level decreased, 21-days’ calcium level increased (P<0.01); biomechanical properties were not statistics difference between TA group and Study group(P> 0.05), and collagen fibers and elastic fibers were maintained well in TA group and Study group. Conclusion Post-treatment on TA-fixed Bovine Jugular Vein can improve stability of storage solution and BJVs elasticity, and do not change anti-calcification, biomechanical properties and fibred structures of TA-fixed BJVs.

Bovine jugular vein；Tannic acid；Calcification；Biomechanics

孫嘉康(1983-)，男，碩士生，助理研究員，主要從事生物材料研究。

周建業(1966-)，男，碩士，研究員,碩士生導師，主要從事生物材料和人工器官研究，E-mail：zhoujy@263.net。

研究報告

R318.0R-332

A

1671-7856(2016) 06-0087-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.014

2016-04-26