駱駝奶對2型糖尿病大鼠糖脂代謝及PPAR-γ、TNF-α mRNA的影響

周　珺，張泉龍，楊　茜，李茂星，邱建國，張汝學

(蘭州軍區總醫院高原環境損傷防治重點實驗室，國家中醫藥管理局臨床中藥學重點學科，蘭州　730050)

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駱駝奶對2型糖尿病大鼠糖脂代謝及PPAR-γ、TNF-α mRNA的影響

周珺，張泉龍，楊茜，李茂星，邱建國，張汝學

(蘭州軍區總醫院高原環境損傷防治重點實驗室，國家中醫藥管理局臨床中藥學重點學科，蘭州730050)

目的研究駱駝奶(CM)對2型糖尿病大鼠體重、血糖、血脂、胰島素，PPARγ和TNF-α基因表達的影響。 方法采用高脂飼料加小劑量(30 mg/kg)鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射誘導2型糖尿病大鼠模型，將其分為4組，即正常對照(control)組、模型(model)組、駱駝奶低劑量(CM-L)組(3.5 mg/kg·d)、駱駝奶高劑量(CM-H)組(10 mg/kg·d)，每周測定體重和血糖，第4周進行葡萄糖耐量實驗，給藥4周后斷頭處死，測定血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、胰島素水平，檢測脂肪組織PPARγ和肝臟組織TNF-α mRNA表達量。結果與正常對照組相比，模型組大鼠體重明顯下降(P< 0.01)，空腹血糖、糖耐量0、30、60、120 min血糖，以及血清TC、TG、LDL-C含量均顯著增高(P< 0.01)，HDL-C含量下降，胰島素水平升高。CM可緩解糖尿病大鼠體重下降，降低高血糖，CM-H組在給藥第4周達到顯著降糖效果，并顯著降低糖耐量30 min血糖(P< 0.05)。CM有降低糖尿病大鼠TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C含量，降低胰島素趨勢，其中CM-H劑量組可顯著降低TG、LDL-C含量(P< 0.05)。與正常對照組比較，模型組PPARγ mRNA顯著下調(P< 0.05)，TNF-α mRNA顯著上調(P< 0.01)，CM使糖尿病大鼠的PPARγ mRNA升高，其中，CM-H組差異顯著(P< 0.05)，CM可降低其TNF-α mRNA表達量。 結論CM可緩解2型糖尿病大鼠體重下降，改善高血糖、糖耐量異常、血脂紊亂等癥狀，其機制可能與調節PPARγ、TNF-α表達有關。

駱駝奶；2型糖尿病；血糖；血脂；PPARγ；TNF-α

2型糖尿病多表現為胰島素分泌不足及胰島素抵抗，現有最有效的降糖藥—胰島素制劑均為注射劑，使用極其不方便。研究發現，駱駝奶(camel milk, CM)中的胰島素含量較高，1 mL駱駝奶中含有52個微單位的胰島素，而等量牛奶的胰島素含量僅為16個微單位[1]。駱駝奶中還含有一種富含半胱氨酸的蛋白質，其氨基酸序列與胰島素蛋白家族極其相似，這種蛋白質就是不被胃酸分解破壞的降糖活性物質—胰島素/ 類胰島素蛋白[2]，因此這種成分被認為是治療糖尿病的功效因子之一。駱駝奶對于糖尿病的防治具有較好的應用前景[3]，臨床試驗證實，患者每天飲用0.5 L駱駝奶，將使胰島素治療用量平均減少30%，有飲用駱駝奶習慣的人群患糖尿病的比率比無飲用駱駝奶習慣的人群下降0.15%～0.3%[4]。然而駱駝奶對糖脂代謝的具體效果不明，其是否參與糖脂代謝關鍵基因的調節。本文采用高脂飼料加小劑量STZ聯合誘導2型糖尿病大鼠模型，通過CM干預，研究CM對糖尿病大鼠糖脂代謝及關鍵基因的影響，探索其對2型糖尿病大鼠脂代謝紊亂的影響并探討其可能機制，為CM應用提供依據。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

Wistar大鼠，清潔級，♀，體重180～220 g，由蘭州大學醫學院動物實驗中心提供【SCXK(甘)2012-0200】，飼養于蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科【SYXK(軍)2012-0029】，普通飼料由該實驗科自行配制，自由攝食進水，室溫19℃～24℃。

1.1.2藥品與試劑

鏈脲佐菌素(STZ，批號S0130)購自Sigma公司；駱駝奶(camel milk, CM,批號191531-740, 規格328 g/罐)購自新疆旺源駝奶實業有限；血糖檢測試劑盒(批號：1210121)、總膽固醇(TC)(批號：1210141)、甘油三酯(TG)(批號：1210111)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(批號：1210081)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)(批號：1210091)檢測試劑盒均購自四川省邁克科技有限責任公司；胰島素(FINS)放射免疫分析試劑盒(批號：20121120)為天津九鼎生物技術有限公司產品；RNAiso Plus(TakaRa，BK4606)；PrimeScriptTM RT Master Mix(TakaRa，DRR036A)；SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ(Ti RNaseH Plus)(TakaRa，RR820A)。 其它試劑均為國產分析純。

1.1.3實驗器材

Vitalab ISP-21半自動生化分析儀，荷蘭Vital Scientific公司；BP210S電子天平，賽多利斯有限公司；Biofuge Stratos高速臺式冷凍離心機，德國Heraeus公司；Multiscan MK3 酶標儀，美國Thermo Electron公司；Telstar Mini-V PCR超凈工作臺，西班牙TERRASSA-SPAIN醫療器械公司；SN-682放射免疫γ-計數器，中國科學院上海原子核研究所日環儀器廠。ABI7300定量PCR儀，美國應用生物系統公司。

1.2方法

1.2.1高脂飼料加小劑量STZ聯合誘導糖尿病大鼠模型的建立

高脂飼料飼養加小劑量STZ聯合誘導建立2型糖尿病大鼠模型。購買的雌性Wistar大鼠在我實驗科適應性飼養1周后，根據體重平均分組，一組為正常對照組(10只)，給與普通飼料，其余均飼以高脂飼料，喂養2個月后大鼠禁食16 h，腹腔注射STZ(30 mg/kg，i.p.)誘發2型糖尿病模型，選取空腹血糖值≥15 mmol/L大鼠納入試驗。

造模成功后，大鼠分為正常對照組、糖尿病組、CM-L組(3.5 mg/kgd)、CM-H組(10 mg/kgd)。正常對照組及模型組每日給予等量蒸餾水，約1 mL/100g 體重。以上各組均為灌胃(i.g.)給藥，連續給藥4周，在末次給藥后大鼠禁食不禁水6 h后斷頭處死并收集軀干血，4000 r/min，4℃離心10 min，將血漿分裝于不同的離心管中-20℃保存待用。

1.2.2體重、血糖

每周測定一次空腹體重和空腹血糖，測血糖前大鼠禁食不禁水6～7 h，眼眶靜脈叢采血；實驗結束時收集血液。0.1 mol/L 肝素鈉抗凝，離心并分離血漿。用葡萄糖氧化酶法測定血漿葡萄糖含量。

1.2.3葡萄糖耐量的測定

實驗動物禁食6 h(8:30～14:30)后，腹腔一次性注射50%葡萄糖(2.5 g/kg)，測定注射 0、30、60、120 min血糖值。

1.2.4血脂、胰島素含量的測定

血漿TG用GPO-PAP法測定，TC用COD-CE-PAP法測定，HDL-C用PTA-Mg2+沉淀法測定，LDL-C用聚乙烯硫酸沉淀法測定。采用放免法測定胰島素含量。

1.2.5RT-PCR檢測脂肪組織PPAR-γ和肝臟組織TNF-αmRNA表達

TRIzol法提取總RNA，一步法逆轉錄合成cDNA。進行實時熒光定量PCR。PPAR-γ(153 bp)上游引物5′ GGAGCCTAAGTTTGAGTTTGC-TGTG3′，下游引物5′ TGCAGCAGGTTGTCTTGG ATG3′；TNF-α(75 bp)上游引物5′ ATACACTGGCC CGAGGCAAC 3′，下游引物5′ CCACATCTCGGA TCATGCTTT-C3′；以β-actin(150 bp)為內參照，上游引物5′ GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA 3′，下游引物5′ GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG 3′。實驗結果采用2-ΔΔCt進行相對定量。

1.2.6統計學處理

2　結果

2.1大鼠體重變化

表1所示，正常組大鼠體重緩慢上升，糖尿病大鼠體重明顯下降(P<0.01)，隨病程的延長糖尿病大鼠體重呈下降趨勢，CM組大鼠體重下降緩慢，但與模型組相比，無顯著統計學意義。

2.2駱駝奶對糖尿病大鼠血糖水平的影響

與正常對照組比較，模型組和CM各組大鼠0～4周血糖值均明顯高于正常對照組(P< 0.01)，與模型組比較，CM有降低2型糖尿病大鼠血糖趨勢，隨實驗進程模型組血糖逐漸升高，CM-H組在給藥第4周達到顯著降糖效果(P< 0.05)。

2.3駱駝奶對糖尿病大鼠糖耐量的影響

與正常對照組相比，糖尿病大鼠0、30、60、120 min血糖均顯著增高(P< 0.01)；CM可降低糖尿病大鼠30、60、120 min血糖，其中CM-H組可顯著降低30 min血糖值(P< 0.05)。

組別Group只數n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)0周0week1周1week2周2week3周3week4周4week正常組Controlgroup60199.70±18.68203.10±19.27208.90±18.14211.40±16.59215.20±18.39模型組Modelgroup60181.86±9.34b175.86±10.33b168.71±12.67b166.86±7.17b164.60±17.98b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.5182.88±12.82b177.00±12.12b175.57±17.46b174.57±14.09b172.67±18.79b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup610182.13±16.44b178.88±15.68b176.75±15.17b175.63±14.11b176.00±13.85b

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group.

組別Group只數n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)空腹血糖(mmol/L)FBG(mmol/L)0周0week1周1week2周2week3周3week4周4week正常組Controlgroup605.51±0.596.21±0.866.23±1.126.30±0.896.37±0.98模型組Modelgroup6019.76±5.43b20.79±4.45b23.64±3.74b24.39±6.51b25.30±5.19b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.519.23±4.91b20.41±4.68b22.82±5.06b22.09±4.00b21.29±5.90b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup61018.33±5.50b19.49±5.02b18.66±6.49b18.31±6.40b18.45±6.01bc

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較；cP<0.05 與模型組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group；cP<0.05 vs model group.

組別Group只數n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)0min0min30min30min60min60min120min120min正常組Controlgroup605.08±0.3613.82±0.588.91±0.967.27±0.88模型組Modelgroup6022.08±2.24b29.57±2.51b28.22±4.82b24.21±2.97b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.522.28±0.73b27.00±2.76b25.67±5.19b22.78±3.63b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup61019.93±1.06b26.43±1.52bc24.50±4.01b20.42±3.53b

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較；cP<0.05 與模型組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group；cP<0.05 vs model group.

組別Group只數n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)總膽固醇TC甘油三酯TG高密度脂蛋白-膽固醇HDL-C低密度脂蛋白-膽固醇LDL-C正常組Controlgroup601.74±0.182.49±1.012.16±0.580.36±0.15模型組Modelgroup604.68±1.43b10.19±3.27b1.71±0.321.23±0.45b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.54.26±1.58b9.56±3.66b1.82±0.341.07±0.39b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup6104.02±1.12b7.11±2.97bc1.76±0.370.75±0.33bc

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較；cP<0.05 與模型組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group；cP<0.05 vs model group.

2.4駱駝奶對糖尿病大鼠血脂水平的影響

表4結果可見：與正常組相比，模型組大鼠TC、TG、LDL-C含量顯著增高(P< 0.01)，HDL-C含量下降。CM-H組可顯著降低TG、LDL-C含量(P< 0.05)。

2.5駱駝奶對糖尿病大鼠胰島素水平的影響

圖1結果顯示：與正常對照組相比，模型組胰島素水平升高，CM可降低糖尿病大鼠的胰島素水平，但無顯著統計學差異(P> 0.05)。

圖1　駱駝奶對胰島素水平的影響Fig.1　Effects of camel milk on insulin ±s)

組別Group只數n劑量(g/kg?d)Dose(g/kg?d)PPARγmRNATNF-αmRNA正常組Controlgroup601.000±0.0001.000±0.000模型組Modelgroup600.821±0.158a1.893±0.661b駱駝奶-低劑量組CM-Lgroup63.50.909±0.1921.675±0.362b駱駝奶-高劑量組CM-Hgroup6101.083±0.137c1.618±0.489b

注：aP<0.05，bP<0.01 與正常組比較；cP<0.05 與模型組比較。

Note：aP<0.05，bP<0.01 vs control group；cP<0.05 vs model group.

2.6RT-PCR檢測脂肪組織PPAR-γmRNA和肝臟組織TNF-αmRNA表達

由表5可見，與正常對照組相比較，糖尿病大鼠PPARγ mRNA顯著下調(P< 0.05)，TNF-α mRNA均顯著上調(P< 0.01)。CM-H顯著升高糖尿病大鼠的PPARγ mRNA(P< 0.05)，同時降低糖尿病大鼠的TNF-α mRNA表達量，但無統計學差異。

3　討論

2型糖尿病常伴隨胰島素抵抗的發生，胰島素敏感性降低，導致胰島素相對缺乏，機體內分泌代謝嚴重紊亂，導致體重的明顯下降。脂肪正常代謝途徑受阻，脂代謝紊亂。而機體內脂蛋白脂酶活力減弱，以及某些代謝關鍵基因的變化，導致游離TC、TG、LDL-C濃度增高，HDL-C濃度減低，肝臟對游離脂肪酸的攝取超過肝細胞處置的能力，導致甘油三酯的堆積[5-8]。本實驗結果證實，糖尿病大鼠血糖水平升高，糖耐量受損，TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，胰島素水平升高。這與相關研究報道一致[8-9]。

研究認為，食物蛋白通過增強飽腹感幫助機體降低脂肪量，間接改善機體代謝健康，同時乳制品蛋白質派生的支鏈氨基酸(BCAAs)的合成代謝促進骨骼肌生長和功能發揮，而BCAAs又可促進肌肉蛋白合成，以及骨骼肌代謝的功能[10]。研究發現，駱駝奶中的胰島素含量較高，1 mL駱駝乳中含有的胰島素是等量牛奶的3.25倍[1]。駱駝奶中還含有一種富含半胱氨酸的蛋白質，其氨基酸序列與胰島素蛋白家族極其相似，這種蛋白質就是不被胃酸分解破壞的降糖活性物質—胰島素/類胰島素蛋白[2]，因此這種成分被認為是治療糖尿病的功效因子之一。

本實驗證實，CM可有效改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝，緩解糖尿病大鼠體重的明顯下降，使體重狀況與正常組接近，不同程度的改善糖尿病大鼠的高血糖、高胰島素和糖耐量異常狀態，降低TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C水平。

PPARγ在糖脂代謝中發揮著重要的作用。本研究發現糖尿病大鼠的PPARγ表達在mRNA水平上明顯低于正常大鼠。作為成脂過程的轉錄因子，糖尿病大鼠胰島素效應組織PPARγ的表達降低，可通過影響前脂細胞分化和成熟脂細胞功能參與胰島素抵抗的形成[11]，而CM可通過升高PPARγ mRNA表達量增加胰島素敏感性。TNF-α是一種主要由炎性細胞分泌的細胞因子，與細胞凋亡和免疫有關。近年來，TNF-α在IR相關疾病中的作用越來越受到重視[12]。有研究報道表明，TNF-α可加速脂肪細胞的脂解，促使游離脂肪酸(FFA)從細胞溢出，參與肥胖及胰島素抵抗的發生[12]。本實驗研究發現，糖尿病TNF-α mRNA均顯著上調，說明其肝臟胰島素抵抗和炎癥損傷的程度較高。CM具有降低TNF-α mRNA表達的趨勢，提示CM可通過調節TNF-α mRNA表達作用改善糖脂代謝紊亂。

綜上所述，CM可改善糖尿病大鼠的糖脂代謝異常狀態，其機制可能與調節糖脂代謝相關基因PPARγ，TNF-α的改變有關。

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Effects of camel milk on glycolipid metabolism and PPARγ、TNFα mRNA expression in rats of type 2 diabetes mellitus

ZHOU Jun, ZHANG Quan-long, YANG Qian, LI Mao-xing, QIU Jian-guo, ZHANG Ruxue

(Key laboratory of the prevention and cure for the plateau environment damage, PLA; Clinical Pharmacy Key Discipline of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050 , China)

ObjectiveTo investigate the effects of camel milk on body weight, blood glucose, lipid, insulin and PPAR-γ、TNF-α mRNA expressions in type 2 diabetes rats. MethodsType 2 diabetes was induced by high fat diet and small dose of STZ(i.g. 30 mg/kg), rats were divided into four groups, normal control(control) group, diabetes model(model) group, camel-low dose(CM-L) group(3.5 mg/kg·d), camel-high dose(CM-H) group(10 mg/kg·d). Body weight and fasting blood glucose were measured every week. Glucose tolerance test(OGTT) was conducted at 4th week. After 4 weeks administration, animals were decapitated, plasma lipid(TC、TG、HDL-C、LDL-C), insulin were assayed. The expression of PPAR-γ and TNF-α mRNA were measured using RT-PCR method. ResultsCompared with control group, the weight of model group lowered significantly(P< 0.01), FBG and blood glucose at 0、30、60、120 min of OGTT, as well as the TC, TG, LDL-C concentrations increased(P< 0.01), while HDL-C content reduced, and insulin level was higher than control rats. Compared with model group, body weight increased and blood glucose decreased in CM group, CM-H reduced the fasting glucose levels in 4th week and decreased the 30min glucose level significantly(P< 0.05). CM lowered the TC, TG, LDL-C, insulin and increased HDL-C concentration, and it is significantly in CM-H(P<0.05). There is a marked decrease in PPARγ mRNA expression(P< 0.05) and a significant increase in TNF-α mRNA expression(P< 0.01)in diabetes rats. Compared with model rats, PPARγ mRNA expression was ascended by CM administration, and it is notably in CM-H group(P< 0.05), while the TNF-α mRNA expression of diabetes rats was lower, but there is no significant. ConclusionsCM can improve the lowered body weight, hyperglycosemia, abnormal glucose tolerance and dyslipidemia in type 2 diabetes. The mechanism of these maybe associated with the regulation of PPARγ and TNF-α mRNA.

Camel milk；Type 2 diabetes mellitus；Blood glucose；Blood lipid；PPARγ；TNF-α

國家自然科學基金資助項目(81173620;30772773)。

周珺(1986-)，女，藥師，碩士，主要從事藥理學研究工作。

張汝學(1963-)，男，碩士生導師，教授。E-mail:zhoujunh@163.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0025-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.004

2016-02-23