殼聚糖導管復合辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠修復大鼠外周神經缺損的研究

郭　琦，劉　燦，海　寶，馬　騰，王　紅，宋純理，徐迎勝

(1.北京大學第三醫院神經內科, 北京　100191；2.北京大學第三醫院骨科, 北京　100191)

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殼聚糖導管復合辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠修復大鼠外周神經缺損的研究

郭琦1，劉燦2，海寶2，馬騰2，王紅2，宋純理2，徐迎勝1

(1.北京大學第三醫院神經內科, 北京100191；2.北京大學第三醫院骨科, 北京100191)

目的探討殼聚糖導管復合辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠作為無細胞人工神經支架修復坐骨神經缺損的可行性。方法制備殼聚糖導管和辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠, 通過體視顯微鏡、掃描電鏡、體外降解實驗和流變學檢測來觀察復合材料的性能。選取SPF級SD大鼠40只, 分為單純導管組、導管復合辛伐他汀0 mg組、導管復合辛伐他汀0.5 mg組, 和導管復合辛伐他汀1 mg組共4組其中前2組為對照組，后2組為辛伐他汀治療組, 每組10只, 造成左側坐骨神經10 mm缺損模型, 用殼聚糖導管橋接缺損, 其內填充不同濃度的辛伐他汀水凝膠。移植后10周, 取再生神經的中間段進行HE染色、透射電鏡觀察再生神經的形態學改變, 并對再生神經的軸突數量、髓鞘厚度、G-ratio等進行統計學分析；免疫組化觀察再生神經中NF200和S100蛋白的表達和神經營養因子PTN、HGF、GDNF和VEGF的表達。結果殼聚糖導管和辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠是適合神經缺損的無細胞修復材料。植入10周后四組均可見再生神經, 但HE染色顯示辛伐他汀治療組的神經干明顯較對照組粗；透射電鏡顯示辛伐他汀治療組的再生軸突數量顯著增多, 髓鞘顯著增厚, G-ratio顯示髓鞘化程度亦明顯好于對照組；免疫組化顯示辛伐他汀治療組再生神經中標記軸突的NF200和標記雪旺細胞的S100的陽性表達明顯增強, 且內源性神經營養因子PTN、HGF、VEGF和GDNF呈現高表達。結論殼聚糖導管復合辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠明顯促進神經缺損組織學的重建, 可用于修復坐骨神經缺損。

外周神經損傷；辛伐他汀；殼聚糖導管；泊洛沙姆407水凝膠；外周神經再生

外周神經缺損一直以來對于基礎和臨床學者來說都是嚴格的挑戰[1]。短距離缺損通過端端吻合即可達到治愈的目的[2], 而對于長距離神經缺損, 自體神經移植雖然被認為是“金標準”, 卻也面臨著一系列的困擾[3]。現今, 人工神經導管復合神經營養因子被認為是自體神經的理想的替代物[4-5]。然而, 單純應用一種外源性神經營養因子不足以支撐外周神經再生的全過程；而且, 外源性神經營養因子大部分都是蛋白質, 存在半衰期短和免疫排斥反應[5]。因此, 利用某種可以誘導內源性神經營養因子分泌的小分子化合物能夠顯著提高促進外周神經再生的效果。

他汀類藥物作為降脂藥, 由于它的抗炎、抗氧化、調節免疫和神經保護作用而被應用在神經系統疾病[6-8]。我們先前的實驗結果表明辛伐他汀能夠顯著促進脊髓損傷大鼠神經功能的恢復, 上調腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、神經膠質細胞源性的神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)表達[9-10]。但辛伐他汀作為降脂藥, 其靶器官是肝臟, 口服后由于肝臟的首過效應, 口服他汀只有不足5%能夠進入血液循環[11], 因此我們期待利用一種緩釋他汀, 提高其生物利用度的載體可以顯著提高受損神經再生的效果。

目前, 關于局部應用辛伐他汀對于外周神經再生的效果仍無報道。我們研究的目的是探索一種辛伐他汀/泊洛沙姆407溫敏型水凝膠復合殼聚糖導管促進坐骨神經缺損10 mm大鼠的外周神經再生的效果。從形態學角度觀察橋接后缺損神經的再生修復情況, 為研究神經缺損的橋接材料提供形態學基礎。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及飼養環境： SPF級SD大鼠, 40只, 雄性, 6～7周齡, 體重250～300 g。均購自于北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2012-0001】。飼養于北京大學醫學部實驗動物科學部【SYXK(京)2011-0039】。按照實驗動物適用的“3R”原則給與人道關懷。實驗前適應性飼養1周, 自由攝取食水。

1.1.2藥品與試劑：辛伐他汀原料藥(中國藥品生物制品檢定所)；殼聚糖(中國浙江金殼藥業)；泊洛沙姆407(德國BASF公司)；一抗NF200和S100(英國Abcam公司)；一抗PTN、HGF、VEGF和GDNF(北京博奧森生物技術有限公司)；一步法聚合物檢測系統、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.1.3主要儀器：體視顯微鏡(德國Leica公司)；光學顯微鏡(日本Nikon公司)；掃描電子顯微鏡(日本JEOL公司)；透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；流變儀(奧利地Anton Paar公司)。

1.2方法

1.2.1殼聚糖導管和辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠的制備與特性檢測

殼聚糖導管的制備參考文獻[12], 略微改良。殼聚糖粉末溶解在冰醋酸中達到8%的濃度。外徑為1.6 mm的玻璃毛細管豎直插入殼聚糖溶液中, 豎直拔出, 再浸入5%的NaOH溶液中30 min, 雙蒸水反復沖洗直至pH值為中性。最后, 拔出玻璃毛細管留下殼聚糖導管, 切成14 mm長度的節段備用。

泊洛沙姆407 粉末溶解在雙蒸水中達到25%的濃度, 添加辛伐他汀至三種劑量, 分別為每20 μL混懸液中含有0 mg, 0.5 mg和1 mg辛伐他汀。水凝膠的流變學檢測利用流變儀, 設置參數為頻率為1 Hz, 幅度為0.1%，彈性模量(G′)和黏性模量(G″)的溫度范圍為4℃～45℃, 以0.5℃/min的速率加溫。

殼聚糖導管填充辛伐他汀/泊洛沙姆407溫敏型水凝膠使用體視顯微鏡觀察宏觀形態。另外, 取一片殼聚糖膜和水凝膠凍干、噴金、掃描電鏡觀察微觀結構。

1.2.2辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠的體外降解實驗

取2 mL辛伐他汀/泊洛沙姆407溫敏型水凝膠置于4.0 mL離心管內并在37℃恒溫箱中孵育呈凝膠狀。再向離心管內添加2 mL PBS。每24 h換一次緩沖液。在第0, 3, 5, 7, 10和14天拍圖觀察水凝膠的降解情況。

1.2.3外周神經損傷模型制作

大鼠麻醉后, 消毒備皮, 于左側大腿外側切開皮膚, 皮下, 沿肌間隙分離暴露坐骨神經, 于梨狀肌下孔5 mm處完全橫斷坐骨神經, 造成10 mm缺口, 兩端用9-0縫線縫合殼聚糖導管, 根據實驗分組填充不同劑量的辛伐他汀水凝膠。傷口處灑青霉素粉末以防感染, 分層縫合肌肉與皮膚, 術后分籠飼養, 每籠3只, 術后觀察大鼠精神狀態、術側肢體活動、飲食、傷口愈合情況等。手術操作過程見圖1。

1.2.4動物分組及給藥

標準分籠飼養的SD大鼠40只, SPF級, 雄性, 6～7周齡, 體重250～300 g, 由北京大學醫學部實驗動物科學部提供, 采用隨機數字表法將40只SD大鼠隨機分為A、B、C、D共 4組, 每組10只：A組：殼聚糖導管組(conduit)；B組：殼聚糖導管復合辛伐他汀水凝膠0 mg(c+sim 0 mg)；C組：殼聚糖導管復合辛伐他汀水凝膠0.5 mg(c+sim 0.5 mg)；D組：殼聚糖導管復合辛伐他汀水凝膠1 mg(c+sim 1 mg)。

1.2.5組織學觀察

術后10周進行組織學觀察。取再生坐骨神經置于10%福爾馬林固定, 脫水, 石蠟包埋。取再生神經最中間段切片(5 μm)行HE染色, 光鏡下觀察。

1.2.6透射電鏡觀察

術后10周進行透射電鏡觀察。取再生坐骨神經置于2.5%戊二醛中固定, PBS沖洗, 鋨酸固定, 脫水, 樹脂包埋。半薄切片(100 nm)行甲苯胺藍染色, 超薄切片(50 nm)行鈾酸-檸檬酸鉛染色。透射電鏡下觀察, 計量髓鞘化軸突的直徑、髓鞘的厚度和G-ratio(軸突直徑與神經纖維總直徑的比值)，并進行統計分析。

1.2.7免疫組織化學觀察

術后10周進行免疫組織化學觀察。取再生坐骨神經置于10%福爾馬林固定, 脫水, 石蠟包埋, 切片(5 μm)孵育一抗NF200和S100, 分別標記軸突和雪旺細胞, 4℃過夜, PBS水洗, 滴加山羊抗IgG/HRP聚合物, 室溫30 min, DAB顯色, 光鏡下觀察。以上一抗濃度均為1∶200。

1.2.8神經營養因子的免疫組織化學觀察

術后10周進行神經營養因子免疫組織化學觀察。取再生坐骨神經置于10%福爾馬林固定, 脫水, 石蠟包埋, 切片(5 μm),孵育一抗多效生長因子(pleiotrophin, PTN)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF), 4℃過夜, PBS水洗, 滴加山羊抗IgG/HRP聚合物, 室溫30 min, DAB顯色, 光鏡下觀察。以上一抗濃度均為1∶200。

1.3統計學分析

2　結果

2.1實驗動物數量分析

參加實驗40只SD大鼠均進入結果分析。術后各組大鼠精神良好, 均成活, 進食及飲水正常, 營養狀況良好, 切口愈合良好、無感染。

2.2殼聚糖導管的特性觀察

如圖2所示, 殼聚糖導管呈現為半透明狀, 直徑為1.6 mm, 長度為14 mm。通過掃描電子顯微鏡可以觀察到良好的微觀結構。

2.3辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠的特性觀察

如圖3，體外降解實驗顯示水凝膠在14d內幾乎降解完全。且通過掃描電子顯微鏡可觀察到水凝膠的多孔狀微觀結構。圖4可見辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠呈現出溫敏性, 即在4℃呈現為液相, 37℃轉為固相。

注：A：暴露手術野；B：橫斷坐骨神經；C：橋接殼聚糖導管；D：注射水凝膠。圖1　手術操作圖Note. A: Exposure of surgical site; B: Transection of sciatic nerve; C: Grafting of chitosan conduit; D: Injection of hydrogel.Fig.1　Pictures of surgical procedure

注：A：殼聚糖導管的大體結構觀察；B：殼聚糖導管的掃描電鏡觀察。圖2　殼聚糖導管特性Note：A: The gross structure of the chitosan conduits; B: The SEM of the chitosan conduits.Fig.2　Characteristics of the chitosan conduits

注：A：水凝膠在體外不同時間的降解情況； B：水凝膠在掃描電鏡下觀察到的多孔狀結構。圖3　辛伐他汀/泊洛沙姆水凝膠特性的觀察Note：A: Degradation of the simvastatin/pluronic F-127 hydrogel at 37℃ on days 0, 3, 5, 7, 10, and 14 in vitro; B: SEM of the simvastatin/pluronic F-127 hydrogel.Fig.3　Characteristics of the simvastatin/pluronic F-127 hydrogel

2.4再生神經在體觀察

如圖5所示, 再生神經在體觀察可發現填充辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠組的再生坐骨神經顯著粗于對照組, 表明其再生情況明顯優于對照組。

注：在彈性模量(G′)和黏性模量(G″)相交接的溫度下, 實現液相-固相的相轉變。圖4　辛伐他汀/泊洛沙姆水凝膠流變學檢測結果Note：It underwent a phase transition from solution to gel at the temperature where the storage modulus (G′) and loss modulus (G″) cross.Fig.4　The rheological properties of the simvastatin/pluronic F-127 hydrogel

2.5再生神經的組織學和免疫組化

如圖6所示, HE染色表明辛伐他汀治療組的再生神經明顯粗于對照組, 且鏡下微觀結構顯示再生神經纖維多且直徑較粗大, 排列更為規則, 較接近正常坐骨神經。

2.6再生神經的組織學和免疫組化

如圖7所示, 辛伐他汀治療組中標記再生軸突的NF(神經絲)陽性細胞數和標記雪旺細胞的S100陽性細胞數顯著多于對照組。

2.7透射電鏡觀察

圖8所示為再生神經中段的甲苯胺藍和醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色結果。如圖9所示, 經統計學分析，辛伐他汀1 mg組的髓鞘化軸突數目最多, 而導管組數目最少。相同的趨勢可在髓鞘化軸突的直徑和髓鞘厚度中可見。并且, 辛伐他汀治療組中再生神經的G-ratio值(軸突直徑與纖維總直徑比值)顯著低于對照組，表明其髓鞘化程度更好。

2.8內源性營養因子的表達情況

如圖10所示,免疫組化表明辛伐他汀誘導內源性神經營養因子包括PTN、HGF、VEGF和GDNF的高表達。

注：辛伐他汀組再生的坐骨神經較對照組明顯增粗。圖5　每組于術后10周再生神經的大體情況Note：The regenerated sciatic nerves in the rats whose defects were bridged by chitosan conduits filled with simvastatin/pluronic F-127 hydrogel were much thicker than that without simvastatin.Fig.5　Gross views of the regenerated sciatic nerves 10 weeks after surgery

圖6　再生坐骨神經中段HE染色觀察Fig.6　The HE staining of the regenerated sciatic nerve

注：A：NF標記再生軸突；B：S100標記雪旺細胞。圖7　免疫組化染色Note： A: NF to lable the regenerated axons; B: S-100 to lable the Schwann cells.Fig.7　The immunohistochemical staining of the regenerated nerves

圖8　再生神經軸突和髓鞘的透射電鏡觀察Fig.8　Observation of the regenerated axons and myelin sheaths by TEM

注：A：再生軸突直徑的統計學分析；B：髓鞘厚度的統計學分析；C：髓鞘化程度(G-ratio)的統計學分析。圖9　再生坐骨神經中段的透射電鏡觀察Note：A: Quantifications of axonal diameter; B: Quantifications of the thickness of the myelin sheaths; C: Quantifications of the G-ratios of the myelinated nerve fibers. Fig.9　Observation of the regenerated nerves by TEM

組別Group軸突直徑(μm)Axonaldiameter髓鞘厚度(μm)Thicknessofthemyelinsheaths髓鞘化程度G-ratio正常組normal3.72±1.181.59±0.680.55±0.10殼聚糖導管組conduit1.67±0.500.39±0.160.68±0.10辛伐他汀0mg組c+sim0mg1.88±0.660.48±0.300.67±0.11辛伐他汀0.5mg組c+sim0.5mg2.17±0.68**0.64±0.29**0.63±0.11*/**辛伐他汀1mg組c+sim1mg2.70±0.89**0.75±0.25**0.64±0.08**

注：對于軸突直徑, 髓鞘厚度：與導管組和辛伐他汀0mg組比較,*P<0.05,**P<0.01；對于G-ratio：與導管組比較,*P<0.05,**P<0.01。

Note: For the axonal diameter and thickness of the myelin sheaths : Compared with the groups of conduit and c+sim 0mg,*P<0.05,**P<0.01; For G-ratio: Compared with the groups of conduit,*P<0.05,**P<0.01.

注：辛伐他汀治療組的局部神經營養因子表達明顯增高。圖10　內源性營養因子PTN、HGF、VEGF和GDNF的免疫組化結果Note：Simvastatin dramatically induces the secretion of PTN, HGF, VEGF and GDNF.Fig.10　The immunohistochemical staining for PTN, HGF, VEGF and GDNF

3　討論

尋找誘導性促進神經再生生物材料一直是神經修復領域研究的熱點。有研究發現, 殼聚糖降解產物可以促進雪旺細胞增殖和神經再生[13], 水凝膠作為可生物降解、良好生物相容性的高分子材料可作為緩釋載體[14-16], 并可填充殼聚糖空導管, 形成軸突再生的有效支架。

本研究中, 我們觀察到了殼聚糖導管中填充辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠可以顯著促進大鼠缺損10 mm的坐骨神經再生, 在組織學上能夠明顯促進神經再生的結構的修復。并且, 在辛伐他汀治療組中與神經再生相關的內源性神經營養因子的分泌包括 PTN、HGF、VEGF 和GDNF也顯著增加。

有研究發現, 短期口服大劑量阿托伐他汀可以預防坐骨神經損傷, 促進睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)高表達[6]；腹腔注射給予辛伐他汀(20 mg/kg/d)能夠促進大鼠坐骨神經挫傷的恢復[17]。相似的, 也有報道稱連續14 d腹腔注射阿托伐他汀(5 mg/kg/d)有助于大鼠坐骨神經完全橫斷后的神經-肌肉再支配的重建[18]。與此相對, 另有報道稱口服給予低劑量辛伐他汀(2 mg/kg/d)連續14 d會延緩神經纖維的再生, 但對電生理檢測并無影響[19]。這相反的結果在某種程度上與他汀在肝臟的首過效應有關, 口服給與的他汀只有少于5%能夠到達系統循環中[11], 而高劑量的辛伐他汀又會引起一系列的副作用[20]。因此, 局部應用辛伐他汀既可以避免副作用, 又可以提高局部辛伐他汀的生物利用度從而有效地促進神經再生。本實驗的數據表明辛伐他汀對于神經再生是很有前景的生物小分子化合物。

大量的神經營養因子在中樞或外周神經損傷中均有促進神經再生的作用[4-5]。人工神經通過緩釋神經營養因子作為神經修復材料取得一定的效果, 但外源性神經營養因子由于其價格昂貴、半衰期短、免疫源性、制備緩釋載體困難及儲備、存儲不便等因素限制了臨床的應用；并且單一的神經營養因子難以滿足神經修復再生的全過程。國內羅卓荊課題組[21]通過c-Jun基因修飾雪旺細胞, 可以促進多種神經營養因子如GDNF, BDNF, LIF等分泌。 同基因修飾等遺傳學方法及通過種子細胞和外源性神經營養因子等組織工程學方法相比, 采用辛伐他汀這一小分子化合物的局部緩釋促進內源性神經營養因子的表達, 促進周圍神經再生, 無疑具有重要的研究價值。

本研究中, 采用的辛伐他汀劑量為0.5、1 mg, 均顯示可顯著促進大鼠周圍神經損傷修復, 但兩者(0.5 mg vs. 1 mg)之間沒有顯著性差異, 結合泊洛沙姆水凝膠的體外降解實驗結果, 2周內即基本完全降解, 提示更小劑量的辛伐他汀即能促進神經再生；同時延長緩釋時間或將更好地發揮促進神經再生的作用。

本研究中, 我們首次報道辛伐他汀顯著增加大鼠外周神經中PTN的分泌、PTN一直以來被認為在體內和體外實驗中具有促進軸突再生的作用[22]。HGF被報道在大鼠坐骨神經損傷[4]、面神經損傷[23]和視神經損傷[24]后均有促進神經再生和功能恢復的效果。最近, 更多的研究表明VEGF也有神經營養和神經保護的作用[25], 加速神經再生和促進神經功能的恢復[26-27]。以上這些發現均表明局部應用辛伐他汀通過促進內源性神經營養因子的分泌來促進缺損坐骨神經的再生。

綜上, 我們的結果表明局部應用辛伐他汀通過增加內源性PTN、HGF、VEGF和GDNF的分泌, 從而促進坐骨神經缺損大鼠模型的神經再生。

[1]Zhan X, Gao M, Jiang Y,etal. Nanofiber scaffolds facilitate functional regeneration of peripheral nerve injury [J]. Nanomedicine, 2013, 9(3): 305-315.

[2]Zhu S, Ge J, Wang Y,etal. A synthetic oxygen carrier-olfactory ensheathing cell composition system for the promotion of sciatic nerve regeneration [J]. Biomaterials, 2014, 35(5): 1450-1461.[3]Matsumoto K, Ohnishi K, Kiyotani T,etal. Peripheral nerve regeneration across an 80-mm gap bridged by a polyglycolic acid (PGA)-collagen tube filled with laminin-coated collagen fibers: a histological and electrophysiological evaluation of regenerated nerves [J]. Brain Res, 2000, 868(2): 315-328.

[4]Li Z, Peng P, Wang G,etal. Effects of local release of hepatocyte growth factor on peripheral nerve regeneration in acellular nerve grafts [J]. Exp Neurol, 2008, 214(1): 47-54.

[5]Ma FK, Xiao ZF, Meng DQ,etal. Use of Natural Neural Scaffolds Consisting of Engineered Vascular Endothelial Growth Factor Immobilized on Ordered Collagen Fibers Filled in a Collagen Tube for Peripheral Nerve Regeneration in Rats [J]. International Journal Of Molecular Sciences, 2014, 15(10): 18593-18609.

[6]Pan HC, Yang DY, Ou YC,etal. Neuroprotective effect of atorvastatin in an experimental model of nerve crush injury [J]. Neurosurgery, 2010, 67(2): 376-389.

[7]Shi XQ, Lim TK, Lee S,etal. Statins alleviate experimental nerve injury-induced neuropathic pain [J]. Pain, 2011, 152(5): 1033-1043.

[8]Morishita S, Oku H, Horie T,etal. Systemic Simvastatin Rescues Retinal Ganglion Cells from Optic Nerve Injury Possibly through Suppression of Astroglial NF-kappa B Activation [J]. Plos One, 2014, 9(1): e84387.

[9]Han X, Yang N, Cui Y,etal. Simvastatin mobilizes bone marrow stromal cells migrating to injured areas and promotes functional recovery after spinal cord injury in the rat [J]. Neurosci Lett, 2012, 521(2): 136-141.

[10]Han X, Yang N, Xu Y,etal. Simvastatin treatment improves functional recovery after experimental spinal cord injury by upregulating the expression of BDNF and GDNF [J]. Neurosci Lett, 2011, 487(3): 255-259.

[11]Schachter M. Chemical, pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of statins: an update [J]. Fundam Clin Pharmacol, 2005, 19(1): 117-125.

[12]Li X, Yang Z, Zhang A,etal. Repair of thoracic spinal cord injury by chitosan tube implantation in adult rats [J]. Biomaterials, 2009, 30(6): 1121-1132.

[13]Wang Y, Zhao Y, Sun C,etal. Chitosan Degradation Products Promote Nerve Regeneration by Stimulating Schwann Cell Proliferation via miR-27a/FOXO1 Axis [J]. Mol Neurobiol, 2016, 53(1): 28-39.

[14]Carballo-Molina OA, Velasco I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries [J]. Front Cell Neurosci, 2015, 9: 13.

[15]Strappe PM, Hampton DW, Cachon-Gonzalez B,etal. Delivery of a lentiviral vector in a Pluronic F127 gel to cells of the central nervous system [J]. Eur J Pharm Biopharm, 2005, 61(3): 126-133.[16]Yang Y, Wang J, Zhang X,etal. A novel mixed micelle gel with thermo-sensitive property for the local delivery of docetaxel [J]. J Control Release, 2009, 135(2): 175-182.

[17]Xavier AM, Serafim KG, Higashi DT,etal. Simvastatin improves morphological and functional recovery of sciatic nerve injury in Wistar rats [J]. Injury, 2012, 43(3): 284-289.

[18]Cloutier FC, Rouleau DM, Hebert-Davies J,etal. Atorvastatin is beneficial for muscle reinnervation after complete sciatic nerve section in rats [J]. Journal Of Plastic Surgery And Hand Surgery, 2013, 47(6): 446-450.

[19]Daglioglu E, Berker M, Demirci M,etal. Microscopic and electrophysiological changes on regenerating sciatic nerves of rats treated with simvastatin [J]. Folia Neuropathol, 2010, 48(1): 49-56.

[20]England JD, Viles A, Walsh JC,etal. Muscle side effects associated with simvastatin therapy [J]. Med J Aust, 1990, 153(9): 562-563.

[21]Huang L, Quan X, Liu Z,etal. c-Jun gene-modified Schwann cells: upregulating multiple neurotrophic factors and promoting neurite outgrowth [J]. Tissue Eng Part A, 2015, 21(7-8): 1409-1421.

[22]Mi RF, Chen WR, Hoke A. Pleiotrophin is a neurotrophic factor for spinal motor neurons [J]. Proceedings Of the National Academy Of Sciences Of the United States Of America, 2007, 104(11): 4664-4669.

[23]Esaki S, KitohCJ, Katsumi S,etal. Hepatocyte growth factor incorporated into herpes simplex virus vector accelerates facial nerve regeneration after crush injury [J]. Gene Therapy, 2011, 18(11): 1063-1069.

[24]Wong WK, Cheung AW, Yu SW,etal. Hepatocyte growth factor promotes long-term survival and axonal regeneration of retinal ganglion cells after optic nerve injury: comparison with CNTF and BDNF [J]. CNS Neurosci Ther, 2014, 20(10): 916-929.

[25]Ruiz de Almodovar C, Lambrechts D, Mazzone M,etal. Role and therapeutic potential of VEGF in the nervous system [J]. Physiol Rev, 2009, 89(2): 607-648.

[26]Pereira Lopes FR, Lisboa BC, Frattini F,etal. Enhancement of sciatic nerve regeneration after vascular endothelial growth factor (VEGF) gene therapy [J]. Neuropathol Appl Neurobiol, 2011, 37(6): 600-612.

[27]Jin K, Zhu Y, Sun Y,etal. Vascular endothelial growth factor (VEGF) stimulates neurogenesis in vitro and in vivo [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(18): 11946-11950.

Bridging sciatic nerve defect with simvastatin delivered by injectable thermosensitive pluronic F-127 hydrogel repairs peripheral nerve defect in rats

GUO Qi1, LIU Can2, HAI Bao2, MA Teng2, WANG Hong2, SONG Chun-li2, XU Ying-sheng1

(1. Department of Neurology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China；2. Department of Orthopedics, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China)

ObjectiveTo explore the feasibility of combining chitosan conduit filled with simvastatin/ pluronic F-127 thermosensitive hydrogel to repair peripheral nerve defects in rats. Methods The chitosan conduits and simvastatin/ pluronic F-127 hydrogel were prepared and tested by stereomicroscope, SEM, vitro degradation testing and rheometer property. A total of 40 Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups (n=10 per group): the chitosan conduit alone (conduit group) or the conduit filled with pluronic F-127 hydrogel containing 0 (c+sim 0mg), 0.5 (c+sim 0.5mg), and 1 mg (c+sim 1mg) simvastatin. A 10mm nerve defect was created in the rat left sciatic nerve and bridged with the chitosan conduit filled with pluronic F-127 hydrogel containing different doses of simvastatin. At 10 weeks after surgery, the regenerated nerves were performed the H&E and TEM to observe the morphological change. The diameters of the myelinated axons, the thickness of the myelin sheath, and the G-ratios (the ratio of the axon diameter to the total fiber diameter) were calculated to make statistical analyses. And the immunohistochemical method was used to measure the expression of NF200 and S100 protein in the regenerated nerves and to detect the expression of neurotrophins including pleiotrophin (PTN), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). Results The chitosan conduits filled with simvastatin/ pluronic F-127 promote nerve regeneration in rats. All groups showed the regenerated nerves, but H&E staining showed that the regenerated nerves in the simvastatin treated groups were much thicker than those without simvastatin; And the same trend was also found for the diameter of the myelinated axons, the thickness of the myelin sheath and G-ratio; In addition, the numbers of NF-positive cells indicating regenerated axons and S100-positive cells indicating Schwann cells were significantly larger in simvastatin treated groups than those without simvastatin. And immunohistochemical staining indicated that simvastatin induced an increased expression of PTN, HGF, VEGF and GDNF compared to those found in the control group. Conclusions Taken together, the simvastatin/ pluronic F-127 hydrogel filling in the chitosan conduits promoted the reconstruction of histological in peripheral nerve defects, which can be used for peripheral nerve regeneration.

Peripheral nerve injury; Simvastatin; Chitosan conduit; Pluronic F-127 hydrogel; Peripheral nerve regeneration

國家自然科學基金(81171693；81100895)；國家高技術研究發展計劃“863計劃”(SS2015AA020304)。

郭琦(1989-)，女，碩士生，研究方向：神經損傷、修復與重建。

徐迎勝(1971-)女，主任醫師，副教授。 E-mail：xys@bjmu.edu.cn。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0001-09

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.001

2016-03-28