纖維素酶輔助青稞粉提取淀粉工藝研究

趙彥巧，朱志勇，王凱，李建穎（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

纖維素酶輔助青稞粉提取淀粉工藝研究

趙彥巧，朱志勇，王凱，李建穎*
（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

采用纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉，以淀粉提取率為評價指標，在單因素試驗的基礎上選擇加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH4個主要影響因素進行正交試驗，確定最佳的提取工藝條件，并將其應用于超聲中試放大試驗。正交試驗結果表明，加酶量、酶解溫度以及酶解時間與酶解溫度的交互作用對淀粉提取率有顯著影響。試驗范圍內獲得的最佳提取工藝條件為：加酶量100U/g、酶解溫度45℃、酶解時間6h、pH4.8，此時，淀粉提取率為80.02%。中試放大試驗結果表明，正交試驗所確定的最佳提取工藝穩定。

青稞；淀粉；提??；纖維素酶

青稞，是生長在我國西北、西南特別是西藏、青海一帶的一種在地區農業生產中占據著極其重要地位的糧食作物，青稞的淀粉平均含量為59.25%，蛋白質平均含量為11.31%，β-葡聚糖平均含量為5%，遠高于其他谷類作物，粗脂肪平均含量為2.13%，此外還含有豐富的水分、纖維和鉬、鉻、硒、鋅等12種人體所需的微量元素［1］。

青稞淀粉具有良好的工業應用價值，而尋找一條簡便高效的青稞淀粉提取工藝路線已成為當前促進青稞淀粉利用急需解決的重要問題之一。本試驗采用纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉，通過單因素試驗確定料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH等因素對淀粉提取率的影響程度，并用正交試驗設計優化纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉的最佳工藝條件，提高淀粉提取率，并在此基礎上進行超聲中試放大試驗，為建立理想的青稞淀粉提取工藝路線及青稞淀粉的利用奠定一定的基礎。

1　材料與方法

1.1材料與設備

青稞：產于云南香格里拉縣；纖維素酶，酶活力（U/ g）≥10 000；α-淀粉酶，酶活力（U/g）≥3 700；羧甲基纖維素鈉、乙醚、碘、碘化鉀、濃鹽酸、乙醇（95%）、氫氧化鈉、次甲基藍、硫酸銅、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、苯酚、無水硫酸鈉、冰醋酸、醋酸鈉等，均為國產分析純。

AUY-220電子分析天平：日本SHIMADZU（島津）公司；WE-3水浴恒溫振蕩器、EMS-2型加熱定時磁力攪拌器、XMTD-204型數顯式電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；DGG-H-3型電熱鼓風干燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司；SK5210LHC超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；PHS-3B型精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；UV-7504型紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；DL-6000型低速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；3-18K低溫高速離心機：德國Sigma公司；TGCXZ-B5組合式超聲循環提取機：北京弘祥隆生物技術股份有限公司。

1.2方法

1.2.1酶解輔助淀粉提取工藝

酶解輔助淀粉提取工藝流程參考Puchongkavarin H［2-3］、張玉玉［4］等的淀粉提取工藝并加以改進，提取工藝如下：青稞粉過100目篩、稱重，按一定料液比加水浸泡制漿，加入纖維素酶、恒溫振蕩水浴酶解一定時間；將酶解液在5 000 r/min進行第一次離心，離心10 min，倒出上清液，刮去上層（暗黃色層），取下層（白色層）；將第一次離心得到的下層（白色層）加水制漿，過200目篩后，淀粉漿在5 000 r/min進行第二次離心，離心10 min，倒出上清液，小心刮去上層（灰色層），收集下層產品；自然條件干燥24 h，得青稞淀粉。

1.2.2淀粉提取率的計算

1.2.3淀粉含量的測定

依據GB/T 5009.9-2008《食品中淀粉的測定》淀粉酶水解法并加以改進測定淀粉含量。

1.2.4纖維素酶比活力的測定

采用普遍使用且結果較為準確的CMC-DNS法［5-6］測定纖維素酶的比活力。

1.2.5超聲輔助中試放大試驗

中試放大試驗將小試劑量放大50倍，稱取1000g過100目篩青稞粉原料，按料液比1∶4（g/mL）加入蒸餾水，采用TGCXZ-B5組合式超聲循環提取機，超聲條件為：超聲時間10 min，頻率30 kHz，間歇比30 s/5 s。超聲后加入纖維素酶，控制各工藝條件與正交優化確定的最佳條件一致。

2　結果與討論

2.1青稞原料中淀粉含量

經測定，本試驗所選用的青稞原料的平均淀粉含量為56.77%，與文獻［1］報道的淀粉平均含量59.25%相當，可以作為試驗原料進行酶解輔助青稞粉提取淀粉的工藝研究。

2.2料液比對青稞淀粉提取的影響

在纖維素酶加入量80 U/g、提取溫度50℃、提取時間8h的條件下，分別按料液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g/mL）進行青稞淀粉的提取，探討料液比對其淀粉提取率的影響，結果見圖1。

圖1　料液比對淀粉提取率的影響Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on starch extraction yield

可以看出，淀粉提取率隨著料液比的增大而逐漸提高。在料液比為1∶3（g/mL）時，由于漿液黏度較大，分子擴散速率較低，體系分散不均勻，不利于酶促反應的進行，因此，淀粉提取率較低。當料液比≥1∶5（g/mL）時，提取率達到最大。若再繼續增加料液比，對淀粉提取率無明顯影響。因此，料液比以1∶5（g/mL）為宜。

2.3加酶量對青稞淀粉提取的影響

在料液比1∶5（g/mL）、提取溫度50℃、提取時間8 h的條件下，分別按加酶量為50、60、70、80、90、100U/g進行青稞淀粉的提取，探討加酶量對其淀粉提取率的影響，結果見圖2。

可以看出，隨加酶量的增加，淀粉提取率呈先增大后減小的趨勢，淀粉提取率最大值出現在加酶量為90 U/g時。當加酶量較少時，由酶促反應動力學可知，加酶量成為酶促反應的主要限制因素，此時酶濃度與反應速度呈正比關系［7］。當加酶量為90 U/g時，酶濃度達到飽和，故提取率達到最大值。當加酶量超過90 U/g時，淀粉提取率出現下降趨勢。纖維素酶是一種復合酶，主要包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等3種酶，作用機制較為復雜［8-9］。此時，漿液中的其它成分可能與纖維素酶作用，影響纖維素酶對植物細胞壁的降解。此外，纖維素酶系中一般還含有一定量的淀粉酶作為輔酶［10］，故當加酶量過大時，其含有的淀粉酶可能降解淀粉，使提取率降低?？疾旒用噶颗c其他因素的交互作用，故選取80、90、100 U/g進行正交試驗。

2.4酶解時間對青稞淀粉提取的影響

在料液比1∶5（g/mL）、纖維素酶加入量80 U/g、提取溫度50℃的條件下，分別提取2、4、6、8、10、12、24 h，探討提取時間對其淀粉提取率的影響，結果見圖3。

圖2 加酶量對淀粉提取率的影響Fig.2　Effect of added-amount of cellulase on starch extraction yield

圖3　酶解時間對淀粉提取率的影響Fig.3　Effect of enzymatic time on starch extraction yield

可以看出，隨酶解時間的增加，淀粉提取率呈先增大后減小的趨勢，最大值出現在酶解時間為6 h。在酶促反應初期，酶活性及反應速率均較高，隨酶解時間的增加，淀粉提取率不斷增加。但當酶解時間超過6 h后，酶促反應基本進行完全，酶解時間過長，可能會造成離心時過多的B淀粉與戊聚糖類物質粘連，從而導致提取率下降［11］?？紤]酶解時間與其他因素可能存在交互作用，故選取4、6、8 h進行正交試驗。

2.5酶解溫度對青稞淀粉提取的影響

在料液比1∶5（g/mL）、纖維素酶加入量80 U/g、提取時間8 h的條件下，控制提取溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，探討提取溫度對其淀粉提取率的影響。結果見圖4。

圖4　酶解溫度淀粉對提取率的影響Fig.4　Effect of enzymatic temperature on starch extraction yield

可以看出，酶解溫度對淀粉提取率的影響較為顯著，隨酶解溫度的增加，淀粉提取率呈現先增大后減小的趨勢，最大值出現在酶解溫度為45℃時。溫度對酶促反應的影響一般呈現鐘罩形曲線［12］，主要是由于溫度較低時，升溫有利于加快反應速率，而當溫度過高時，蛋白質變性而使酶失活；此外，較高的溫度也可能使提取出的淀粉糊化而影響淀粉提取效果，因此提取率在酶解溫度超過45℃后開始下降。故選取40、45、50℃進行正交試驗。

2.6pH對青稞淀粉提取的影響

在料液比1∶5（g/mL）、纖維素酶加入量80 U/g、提取溫度50℃、提取時間8 h的條件下，分別調節浸提液的pH為3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6，探討pH對其淀粉提取率的影響，結果見圖5。

圖5pH對提取率的影響Fig.5　Effect of pH on starch extraction yield

可以看出，在試驗范圍內，隨pH的增加，淀粉提取率先增大后減小，提取率最大值出現在pH為4.4時。pH對酶促反應的影響一般也呈鐘罩形曲線，存在酶的最適pH［10］。pH是酶促反應的主要影響因素之一，故選取pH為4.0、4.4、4.8 3個水平進行正交試驗。

2.7正交試驗優選提取工藝

在單因素試驗的基礎上，根據加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH 4個因素對淀粉提取率的影響，并考慮酶解時間和酶解溫度、酶解時間和加酶量以及酶解溫度和加酶量三組交互作用，采用正交試驗優化，以淀粉提取率為評價指標，以確定提取青稞淀粉的最佳工藝條件，因素水平表見表1。選用L27（313）表，正交試驗結果及極差分析表見表2。

表2 正交試驗結果及極差分析表Table 2　The result and range analysis of orthogonal test

表1　正交試驗的因素水平表Table 1　Factor-levels of orthogonal test

由表2可以看出，各因素對淀粉提取率的影響次序是：C（加酶量）＞B（酶解溫度）＞A×B＞A×C＞A（酶解時間）＞B×C＞D（pH）。影響淀粉提取率的主要因素是C、B 和A×B，其他因素和交互作用的影響均較小。因素水平的選取，C應取C3，B應取B2。因素A和B的交互作用很大，甚至超過了因素A的單獨作用，因此必須考慮因素A和B水平的最優搭配。根據表2，列出二元分析表如表3所示。

表3　A、B交互作用二元分析表Table 3　Bivariate analysis of the interaction between factor A and B

由表3可見，A2B2的淀粉提取率最高，與單獨考慮因素A和B的結果一致。由于因素D的影響最小，可任取一水平，考慮到提取工藝的經濟性和簡便性以及對實際生產中設備的耐酸性要求，宜選擇較高的pH，即取D3。最后得到試驗范圍內的最佳工藝條件為A2B2C3D3，即當加酶量為100 U/g，調節pH 4.8，在45℃下酶解6 h時，淀粉提取效果最佳。

根據正交優化試驗確定的最佳提取工藝條件進行酶解輔助青稞粉提取淀粉驗證試驗，做3組試驗取平均值，淀粉提取率為80.02%，與正交優化試驗中A2B2C3D3組合（正交試驗號15）的提取率79.52%接近，證明該優化工藝條件較為穩定，可以進行中試放大試驗。

2.8超聲中試放大試驗的結果與分析

在正交優化試驗基礎上進行超聲中試放大試驗，中試放大試驗的結果顯示，青稞淀粉提取率為83.54%，淀粉提取率較正交試驗的驗證試驗結果有所提高，其原因可能是超聲有利于青稞細胞壁的破碎從而使淀粉更多的溶出，淀粉提取率上升。

3　結論

本試驗采用纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉，以淀粉提取率為評價指標，在單因素試驗的基礎上選擇加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH 4個主要影響因素進行正交試驗，得到纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉的最佳工藝條件，并進一步進行超聲中試放大試驗，得出如下主要結論。

1）在試驗范圍內，各因素對淀粉提取率的影響次序是：C（加酶量）＞B（酶解溫度）＞A×B＞A×C＞A（酶解時間）＞B×C＞D（pH），其中加酶量、酶解溫度以及酶解時間與酶解溫度的交互作用對提取率有顯著影響。

2）在試驗范圍內，纖維素酶輔助從青稞粉中提取淀粉的最佳工藝條件為：當加酶量為100 U/g，調節pH 至4.8，在45℃下酶解6 h時，淀粉提取效果最佳，提取率為80.02%。

3）通過驗證試驗及超聲中試放大試驗可以認為試驗確定的最佳提取工藝條件較為穩定，通過酶解輔助青稞粉提取淀粉的最終產率達80%左右，提取效果良好，可以為建立適應實際生產規模的酶解輔助青稞粉提取淀粉的工藝路線奠定基礎。

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Study on Starch Extraction from Highland Barley Flours Assisted by Cellulase

ZHAO Yan-qiao，ZHU Zhi-yong，WANG Kai，LI Jian-ying*
（College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Tianjin 300134，China）

Starch was extracted from highland barley flours assisted by cellulose.In order to find the best conditions of enzymatic hydrolysis，with the starch extraction yield as the evaluation index，an orthogonal test was adopted to investigate added-amount of cellulase，enzymatic time，enzymatic temperature and pH value based on the results of single-factor tests.According to the best extraction conditions obtained，ultrasonic pilot enlarge experiment was carried out.The result of the orthogonal optimization test showed that added-amount of cellulase，enzymatic temperature，as well as the interaction between enzymatic time and enzymatic temperature have significant effects on the starch extraction yield.The best extraction conditions would be：added-amount of cellulase was 100 U/g，enzymatic temperature was 45℃，enzymatic time was 6 h and pH value was 4.8，under which the starch extraction yield from highland barley was 80.02%.The result of the ultrasonic pilot enlarge experiment indicates that the best extraction conditions obtained by the orthogonal optimization test were stable.

highland barley；starch；extraction；cellulase

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.022

天津市高校“優秀青年教師資助計劃”；天津市高校科技發展基金項目（140023）；天津市教育科學“十二五”規劃重點研究課題（HE3024）；天津市科學技術普及項目（13KPXM01SY008）

趙彥巧（1979—），女（漢），副教授，博士，研究方向：天然產物的提取與分離。
*

李建穎（1961—），女（漢），教授，碩士，研究方向：天然化合物提取和生物化工。

2015-04-08