發(fā)酵酒中尿素的檢測

張穎，劉國新，胡翠翠，張健，*（.食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

發(fā)酵酒中尿素的檢測

張穎1，劉國新2，胡翠翠2，張健2，*
（1.食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

發(fā)酵酒中尿素檢測方法主要包括比色法、酶法和色譜法，綜述了這3種方法的檢測原理，并闡述了這些方法的優(yōu)缺點及適用條件，最后展望了尿素檢測的發(fā)展趨勢

尿素；發(fā)酵酒；氨基甲酸乙酯；檢測

尿素又稱碳酰二胺、碳酰胺、脲，廣泛存在于發(fā)酵酒中。除原料引入和人為添加外，釀酒酵母的氮代謝亦是發(fā)酵酒中尿素的主要來源。大量研究發(fā)現(xiàn)，尿素和乙醇在自然條件下反應(yīng)可生成氨基甲酸乙酯（EC）［1-2］，而EC已經(jīng)被證實是一種潛在的人類致癌物質(zhì)。2002年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織將EC納入重點監(jiān)控物質(zhì)；2007年，國際癌癥研究機構(gòu)將EC認定為“2A”類致癌物；很多國家已經(jīng)制定了氨基甲酸乙酯在不同發(fā)酵酒中的限量標準［3］。雖然EC的前體物質(zhì)很多，但尿素被認為是EC的主要前體，尿素的含量可以反映發(fā)酵酒中潛在的EC含量。不僅如此，尿素還在酵母的氮代謝中扮演重要角色，并通過氮代謝物阻遏效應(yīng)影響酵母對其他氮素的吸收，從而影響發(fā)酵酒的品質(zhì)。因此準確測定發(fā)酵酒中的尿素含量具有重要的意義。

1　發(fā)酵酒中尿素的檢測方法

尿素的檢測方法很多，每種方法都有自身的局限性和適用范圍，尚無通用的可檢測任何樣品中尿素含量的方法［4-6］。如在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，酶法測定尿素較為適宜，這是因為酶法測定速度快、安全無毒；而在環(huán)境領(lǐng)域，非酶法更為常用，這是因為環(huán)境中可能會存在酶抑制劑，這會影響酶法測定的準確性。發(fā)酵酒品種多樣、基質(zhì)復(fù)雜，尿素含量差別很大。如葡萄酒中的尿素含量通常在3 mg/L以下，而日本清酒中的尿素含量在5 mg/L～80 mg/L之間［7］。尿素在發(fā)酵酒釀造過程中處于不斷的動態(tài)變化中，在不同的發(fā)酵階段其含量可能低至μg/L的水平。這些特點要求發(fā)酵酒的尿素測定方法要具備高靈敏度、精密度和準確度。迄今為止，發(fā)酵酒中尿素的檢測方法主要分為3類：比色法、酶法和色譜法。本文將綜述這些方法，分析其優(yōu)缺點及適用條件，并展望尿素檢測方法的發(fā)展趨勢。

1.1比色法

尿素與顯色劑在一定條件下反應(yīng)生成帶有顏色的化合物，該化合物顏色深淺程度與樣品中尿素含量呈正比，因此可以通過測定特定波長下反應(yīng)溶液的吸光值來確定樣品中的尿素含量。已報道的尿素顯色反應(yīng)很多，但測定尿素的只有兩大類，即基于二乙酰一肟的反應(yīng)和基于2-異亞硝基苯丙酮的反應(yīng)，每類反應(yīng)又有很多的改進和修飾。

1939年，F(xiàn)earon研究發(fā)現(xiàn)尿素和二乙酰在酸性條件下反應(yīng)顯黃色，而不同的尿素氨基取代物能和二乙酰（圖1a）反應(yīng)生成紅色、暗紅色或紫紅色化合物，該反應(yīng)即為Fearon反應(yīng)［8］。二乙酰一肟和尿素的顯色反應(yīng)正是由Fearon反應(yīng)演化而來的，使用二乙酰一肟（圖1b）取代二乙酰作為反應(yīng)物克服了二乙酰穩(wěn)定性差的缺點，其基本反應(yīng)原理為，二乙酰一肟首先在酸性條件下解離為二乙酰和羥胺，然后二乙酰與尿素在酸性、加熱的條件下形成紅色衍生物，該反應(yīng)產(chǎn)物顏色深淺程度與樣品溶液中尿素含量呈正比。此后，眾多學(xué)者在提高該檢測方法的精密度和準確性等方面做了大量工作［9］，如在反應(yīng)體系中加入氨基硫脲可有效鈍化紅色產(chǎn)物的光敏性，顯著提高該物質(zhì)的顏色穩(wěn)定性，增大線性范圍；加入Fe3+可除去反應(yīng)二乙酰一肟水解副產(chǎn)物羥胺，從而增強反應(yīng)顯色效果；加入安替比林或4-氨基安替比林可增大反應(yīng)的線性范圍。

圖1　光譜測量的試劑Fig.1　Spectrophotometric reagents

二乙酰一肟法是檢測游泳池水中尿素的國標方法，也普遍應(yīng)用于測定環(huán)境樣品和發(fā)酵酒等樣品中的尿素。1970年，Douglas等［10］采用該法來測定土壤樣品中的尿素，2004年，Hasnip等［11］在研究時間和溫度對葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成的影響時，采用該法在3年的時間跨度內(nèi)準確測定了尿素含量。陳宜宜等［12］添加氨基硫脲和氯化鐵改進該法，在酸性條件下成功檢測了黃酒中的尿素。梁新紅等［13］通過優(yōu)化反應(yīng)條件，顯著提高了該方法的精密度和準確度，測定葡萄酒中的尿素含量，檢測限可達0.5 mg/L，能夠滿足葡萄酒樣品中尿素常規(guī)檢查的要求。

1989年，Ough等［14］建立了另一種比色法，即采用1-苯基-1，2-丙二酮-2-肟（2-異亞硝基苯丙酮；圖1c）作為基礎(chǔ)試劑與尿素反應(yīng)，然后在540 nm下檢測吸光值。這種方法已被Ough和許多學(xué)者應(yīng)用于釀酒酵母的氨基酸代謝研究和葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成的研究。1-苯基-1，2-丙二酮-2-肟與二乙酰一肟相比，穩(wěn)定性更好，并且沒有難聞的氣味，但產(chǎn)生的有色產(chǎn)物對光更加敏感，導(dǎo)致試驗結(jié)果的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性比較差。Nagel［15］和Monteiro的報道中［16］，葡萄酒中尿素的檢測限均為1 mg/L，但也有報道采用該法測定尿素檢測限更低［17］。

綜上，比色法涉及的試劑較多，且有很多修飾和改進，不同的反應(yīng)條件導(dǎo)致產(chǎn)物顏色不盡相同，從而影響到了檢測波長的選擇以及檢測的靈敏度和準確度。只有通過系統(tǒng)性研究，明晰各種比色法的優(yōu)缺點和適用條件，才能充分發(fā)揮各種方法的優(yōu)勢，才能規(guī)范針對發(fā)酵酒中尿素檢測的比色法。

1.2酶法

脲酶（EC3.5.1.5）又稱尿素酰胺水解酶，相對分子質(zhì)量為120 000 Da～130 000 Da，廣泛存在于豆類植物籽實和細菌中，能特異性水解尿素形成氨氣和二氧化碳。大多數(shù)脲酶的最適pH在中性或偏堿性范圍內(nèi)，但是源于腸道乳酸菌體內(nèi)的酸性脲酶最適pH在2～4之間。酸性脲酶非常適合在發(fā)酵酒環(huán)境中分解尿素，生成的氨氣或二氧化碳，通過測定生成的氨氣或二氧化碳含量，即可間接測定尿素含量。體系中的pH、乙醇、有機酸和氟化物的含量對酸性尿酶活力有一定的影響［18］，因此在測定尿素前需要對樣品進行前處理，使酸性脲酶能在最適條件下反應(yīng)。

現(xiàn)已開發(fā)出基于酶法中氨氣測定的尿素檢測試劑盒，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵酒中的尿素檢測［19-20］。其原理是利用酸性脲酶水解尿素生成氨氣和二氧化碳（反應(yīng)式1），氨氣與2-酮戊二酸和原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在谷氨酸脫氫酶（GLDH）作用下反應(yīng)生成谷氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和水（反應(yīng)式2）。在340 nm處檢測NADH的吸光值，根據(jù)NADH的減少量與氨的減少量成正比，即可測定樣品中的尿素含量。樣品的色澤和渾濁度對測定有一定的干擾，因此需用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）吸附樣品中的色素，并用0.45 μm濾膜過濾除雜。試劑盒可以測定25 μL～50 μL的微量樣品，通過增加樣品含量可實現(xiàn)對樣品中微量尿素的定量。由于試劑盒內(nèi)NADH不穩(wěn)定，容易被氧化，會造成吸光度下降，因此在每次測量前需要重新進行定標。此方法對尿素標品的檢測限通常為0.15mg/L，但對于實際樣品中的尿素，檢測限僅為1 mg/L［21］。

Satoh等［22］將脲酶固定化，通過溫度控制的氣體擴散單元將直接氨氣導(dǎo)入溴百里酚藍溶液，在596 nm下測量百里酚藍溶液的吸光值來確定尿素的含量，開發(fā)了流動注射-分光光度法提高了尿素測定的準確度、精密度和自動化程度。Ilda等［23］開發(fā)了類似的方法來檢測清酒中尿素的含量。因為清酒中的其他的氨類物質(zhì)含量很高，可達尿素含量的6倍～10倍，所以該方法采用了離子交換法對樣品進行前處理。只要樣品中的乙醇濃度低于5%，尿素檢測就不受影響，線性范圍在0.5 mg/L～60 mg/L。Ilda課題組［24］還用該法測定了黃酒中的尿素含量，并且與前述的試劑盒法測定的結(jié)果進行了對比，結(jié)果無顯著差別。

基于酶法中二氧化碳的測定亦可檢測尿素［25-26］。將樣品流動注射到載有酸性脲酶的固體柱里，通過氣體擴散裝置分離的二氧化碳，透過膜擴散到溴百里酚藍溶液中，通過測定溶液在617 nm處的吸光度來檢測二氧化碳的含量，進而得出尿素的濃度。該法無需去除樣品中的其他氨類物質(zhì)，但尿素水解所產(chǎn)生的二氧化碳含量僅是氨氣含量的一半（反應(yīng)式1），并且有潛在空氣污染的危險。Iida等［27］采用了標準添加技術(shù)，大大地提高了該法檢測尿素的靈敏度。

1.3色譜分離法

過去，采用高效液相色譜法（HPLC）測定發(fā)酵酒中尿素的報道不多，這是因為所用的檢測器多為紫外檢測器（UV），而尿素的最大吸收波長在203 nm，在此波長下，很多物質(zhì)都有吸收，從而造成尿素的檢測靈敏度不夠，檢測限很高。1990年，F(xiàn)ujinawa等［28］開發(fā)了離子對色譜結(jié)合熒光檢測器測定葡萄酒中的尿素，其原理是利用固定化脲酶分解尿素產(chǎn)生氨，氨與OPA衍生化后生成產(chǎn)熒光化合物，經(jīng)離子對色譜分離后可用熒光檢測器（FLD）檢測。該方法靈敏度高，但樣品前處理繁瑣，需經(jīng)過過濾、脫醇、離子交換、C18預(yù)柱除雜等步驟。1995年，Kodama等［29］優(yōu)化了該方法，顯著地減少了分析時間，降低了尿素的檢出限。同年，Matsudo等［30］在酸性條件下，將尿素與二乙酰一肟、安替比林和氯化鐵在120℃下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)凝膠柱分離后，在波長466 nm處進行檢測，間接測定了尿素含量。此方法借鑒了二乙酰一肟與尿素的反應(yīng)原理，樣品制備相對比較簡單，但該法靈敏度太低，且其他氨酰化合物會對結(jié)果造成嚴重干擾。

近年來，有研究者開發(fā)了新的HPLC-FLD方法來檢測發(fā)酵酒中的尿素含量［31-32］。其原理為酸性條件下，9-羥基噸與尿素反應(yīng)可生成噸基脲（如圖2），噸基脲受特定波長激發(fā)光照射后，可發(fā)射出特定波長的發(fā)射光，通過測定衍生物的發(fā)射光強度即可對樣品中的尿素進行定量。事實上，9-羥基噸可與很多氨酰化合物發(fā)生反應(yīng)，而很多反應(yīng)產(chǎn)物都可發(fā)出熒光。根據(jù)此原理，本課題組［33］在近期開發(fā)了一種可以同時檢測發(fā)酵酒中尿素和氨基甲酸乙酯的方法，在發(fā)酵酒中尿素和氨基甲酸乙酯的檢測中得到了很好的應(yīng)用。

1.4其他方法

除了以上方法外，楊珩等［34］還開發(fā)了一種簡單、快速的試紙條定性、半定量的尿素測定方法，此法操作簡單，但只能對尿素進行定性，不能應(yīng)用于實際測量。近年來，也有用近紅外光譜法［35］和質(zhì)譜法［36］來分析尿素含量的報道，這兩種方法最顯著的優(yōu)勢是分析操作簡單、快速，但設(shè)備價格昂貴，在很多工廠和實驗室不能實現(xiàn)。

圖2反應(yīng)示意圖Fig.2　The schematic diagram of the derivative reaction

2　發(fā)酵酒中尿素檢測的發(fā)展方向

綜上所述，發(fā)酵酒中尿素的檢測方法很多，但每種方法都有各自的缺點，比如分光光度法顯色試劑的不穩(wěn)定性，反應(yīng)中有其他成分的干擾；酶催化水解法中，樣品制備繁瑣，樣品中其他氨類物質(zhì)和大氣中的CO2同樣會干擾測定結(jié)果；色譜分離法對設(shè)備要求高等等。因此對以上方法有針對性地改進是尿素檢測重要的發(fā)展方向，如：分光光度法可以結(jié)合順序標準注射分析，酶催化法時可以結(jié)合在線固相萃取流動注射分析，色譜分離法分析設(shè)備的改進等，也可以通過自動化程序的協(xié)助來縮短分析時間［37-38］。在實際應(yīng)用中，需綜合考慮尿素不同檢測方法的特點及適用性，發(fā)揮不同方法的優(yōu)勢，滿足不同的分析要求。

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The Determination of Urea in Fermented Liquors

ZHANG Ying1，LIU Guo-xin2，HU Cui-cui2，ZHANG Jian2，*
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

This article reviewed the principle of the colorimetry，enzyme and chromatography for urea detection in fermented liquors，and summarzed the advantages and disadvantages，as well as the applied conditions of these methods，in the end，proposed the tendency for urea detection.

urea；fermented liquors；ethyl carbamate；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.050

國家自然科學(xué)基金資助項目（31101275；31201354）

張穎（1978—），女（漢），高級實驗師，碩士，主要從事食品安全方面的研究。
*

2015-12-14