長白山榛子抗氧化肽制備及其活性研究

李京京，孫文佳，閔偉紅，*（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春130118）

基礎研究

長白山榛子抗氧化肽制備及其活性研究

李京京1，2，孫文佳1，2，閔偉紅1，2，*
（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春130118）

以長白山榛子分離蛋白為原料，采用堿性蛋白酶制備抗氧化肽，通過Box-Behnken中心組合試驗確定最佳水解工藝條件為：酶解溫度50℃、加酶量8 000 U/g、底物濃度5.0%、pH9.5。對該條件制備的抗氧化肽進行活性研究，結果顯示隨著濃度的升高，榛子抗氧化肽在4mg/mL時對ABTS自由基和DPPH清除率均達到100%，8mg/mL時對·OH清除率和總還原能力分別達到85.46%和0.859，12mg/mL時，對Fe2+螯合率達到99.3%。

榛子分離蛋白；抗氧化肽；酶解工藝優化；抗氧化活性

人體過量積累自由基會導致細胞死亡、組織受損、糖尿病和冠狀動脈硬化等許多慢性疾?。?-2］。與人工合成的抗氧化劑相比，植物蛋白酶解得到的抗氧化肽，因其易于人體吸收和安全無副作用更受人們的青睞［3-5］。其抗氧化機理包括：為抗氧化酶提供氫、緩沖生理pH、螯合金屬離子和捕捉自由基等［6］。

榛子（corylus heterophylla fisch.ex trantv），與扁桃、核桃、腰果并稱“四大堅果”，在中國東北地區分布尤為廣泛。榛子仁不僅口味佳而且營養價值高，富含蛋白質、脂肪、碳水化合物以及維生素和多種礦物質。其中脂肪57.1%～62.1%，蛋白質16.2%～21.12%，碳水化合物6.5%～9.3%。榛子仁除可直接食用或添加到食品中外，還可以榨油。目前國內對榛子的研究主要集中在榛子油，榛子果奶以及榛子蛋白等方面［7］。國外對榛子的研究則集中在過敏原方面［8-10］，對蛋白和多肽的研究普遍較少。本試驗采用響應面分析法對酶解制備榛子抗氧化肽進行工藝優化，并在此基礎上研究其抗氧化活性，為榛子蛋白的充分利用和榛子多肽功能性產品的開發提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

榛子分離蛋白：實驗室自制。DPPH、ABTS、菲洛嗪：購于sigma公司；Alcalase 2.4L，堿性蛋白酶：購于丹麥諾維信公司；其他均為國產分析純。

1.2儀器與設備

UV-1700型紫外可見分光光度計：日本島津；SPECTRA-MAX190型酶標儀：美國Molecular Devices公司；ZD-2型自動電位滴定計：上海儀電科學儀器股份有限公司；BSA224S型分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）儀器有限公司；XMTD-8222型水浴鍋：精宏儀器公司；FD-1B-50型冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；Z36HK型高速冷凍離心機：德國HERMLE公司。

1.3試驗方法

1.3.1榛子抗氧化肽制備

取榛仁分離蛋白粉，加入蒸餾水配成一定底物濃度的溶液，90℃水浴10 min。冷卻后調節pH，加入堿性蛋白酶，電位滴定計滴加堿液維持溶液pH恒定。酶解一定時間后，溶液90℃滅酶20 min，冷卻至室溫，調節pH至7.0，5 000 r/min離心10 min取上清液，冷凍干燥后得到榛仁抗氧化肽。

1.3.2羥基自由基（·OH）清除能力測定

利用Fenton反應，參照Amarowicz的試驗方法。

1.3.3響應面法優化榛子抗氧化肽的酶解制備工藝

試驗運用Design-Expert 8.0.6.1軟件，采用響應曲面法的中心組合設計，以羥基自由基清除能力為指標對酶解條件進行優化。根據單因素試驗結果，選出影響較大的4個因素，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，開展四因素三水平的響應面試驗，試驗因素及水平表見表1。

表1 響應面分析因素水平表Table 1　Factors and their coded levels teasted in response surface analysis

1.3.4還原能力測定

參照Lin［12］的試驗方法。

1.3.5ABTS清除作用的測定

參照Memarpoor-Yazdi［13］的試驗方法。

1.3.6DPPH自由基清除能力測定

參照Wang［14］的試驗方法。

1.3.7Fe2+螯合能力測定

參照Yu-Ling Lee［15］的試驗方法。

2　結果與分析

2.1響應面試驗

2.1.1響應面試驗結果及分析

選取底物濃度、酶解溫度、pH、加酶量四因素，酶解時間為300 min。酶解制備榛子抗氧化肽工藝的響應面分析試驗根據Box-Behnken設計進行了29組試驗，其中5組中心點重復試驗，結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2　Box-Behnken design and results for response surface analysis

以·OH清除率為響應值回歸擬合所得各因素函數表達如下：

清除率/%=48.24+1.43X1-3.18X2+5.22X3-0.54X4-2.15X1X2+1.40X1X3-0.95X1X4-1.50X2X3-0.28X2X4-0.80X3X4-2.74X12-4.78X22-4.94X32-3.23X42

由表3方差分析得出P值，模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數R2=0.976 7修正決定系數R2Adj=0.953 3，說明方程擬合性較好，可以應用于對酶解條件的分析預測。根據結果進行分析：一次項X1、X2、X3極顯著，二次項X12、X22、X32、X42極顯著。說明該模型擬合程度良好，用該模型對酶解制備榛子抗氧化肽的工藝進行優化是合適的。

各因素交互作用影響·OH清除率的響應面圖見圖1。

表3 回歸模型方差分析Table 3　Regression and the Analysis of Variance

圖1 各因素交互作用影響·OH清除率的響應面圖Fig.1　Response surface of mutual influence on scavenging capacities of hydroxyl radical

從圖中可以直觀地反映各因素對響應值的影響，找出最佳工藝參數以及各參數之間的相互作用。

2.1.2酶解制備榛子抗氧化肽工藝條件的確定及驗證

數據分析表明回歸模型存在最大值，酶解制備榛子抗氧化肽的最佳工藝條件為：酶解溫度52.24℃、加酶量7 741.14 U/g、底物濃度5.22%、pH 9.38。此條件下羥基自由基清除率理論預測最大值為51.74%。采用優化后的最佳工藝條件進行驗證試驗，同時考慮到實際操作的情況，將條件修正為：pH9.5，溫度50℃，加酶量8 000 U/g，底物濃度5.0%，在此條件下做驗證試驗，得到清除率為50.98%，與模型預測值較為吻合。采用響應面法優化得到的酶解榛子分離蛋白工藝條件比較可靠，具有一定的實用價值。

2.2榛子抗氧化肽粗提物抗氧化活性測定

2.2.1ABTS自由基清除能力測定結果

榛子抗氧化肽對ABTS自由基的清除作用見圖2。

圖2 榛子抗氧化肽對ABTS自由基的清除作用Fig.2　Scavenging effect of hazelnut antioxidant peptide with ABTS radical

由圖2可知，酶解產物濃度達到3 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率就已經達到96.43%。試驗濃度范圍內，酶解產物對ABTS自由基清除率在3 mg/mL以后保持在98%～100%，此時酶解產物和VC對ABTS自由基的清除率基本相同，即酶解產物對ABTS自由基的清除率為VC的100%。說明酶解產物對ABTS自由基有較強的清除作用，具有較強的抗氧化活性。

2.2.2DPPH自由基清除能力測定結果

榛子抗氧化肽對DPPH自由基清除能力如圖3所示。

圖3榛子抗氧化肽對DPPH自由基的清除作用Fig.3　Scavenging effect of hazelnut antioxidant peptide with DPPH radical

榛子抗氧化肽對DPPH自由基的清除率隨濃度的增大而升高，并在2 mg/mL后逐漸穩定，8 mg/mL時達到100%，此時酶解產物和VC對DPPH自由基的清除率一致，即酶解產物對DPPH自由基的清除率為VC的100%。說明酶解產物對DPPH自由基有較強的清除作用，具有較強的抗氧化活性。

2.2.3·OH清除能力測定結果

試驗結果如圖4所示。

圖4　榛子抗氧化肽對羥基自由基的清除作用Fig.4　Scavenging effect of hazelnut antioxidant peptide with hydroxyl radical

榛子抗氧化肽對羥基自由基的清除作用隨濃度的增加而顯著提高，當濃度為8 mg/mL時，清除率到達85%以上，并在24 mg/mL時達到100%。

2.2.4總還原能力能力測定結果

試驗過程中，有還原能力的樣品能使鐵氰化鉀中的Fe3+還原成Fe2+（亞鐵氰化鉀），產物與FeCl3進一步反應生成在700 nm處有最大吸光峰的普魯士藍（Fe4［Fe（CN）6］3），因此測定700 nm處吸光值的高低可以反映樣品還原能力的大小，吸光值越大，則還原能力越強。試驗結果如5圖所示。

圖5　榛子抗氧化肽的還原能力作用Fig.5　Reducing power of hazelnut antioxidant peptide

隨著濃度的升高，榛子抗氧化肽的還原能力逐漸增強，100 mg/mL時，A700值為1.055，能夠達到同濃度下EDTA的38.55%

2.2.5Fe2+螯合能力測定結果

試驗結果如圖6所示。濃度為10mg/mL時抗氧化肽的螯合率為90.25%，12 mg/mL時達到99.30%。可見榛子抗氧化肽對Fe2+有較好的螯合能力。

圖6　榛子抗氧化肽對亞鐵離子的螯合作用Fig.6　Ferrous ions chelating capacity of hazelnut antioxidant peptide

3　結論

本試驗以長白山榛子分離蛋白為原料，用堿性蛋白酶酶解，響應面分析法確定最佳水解工藝條件為：酶解溫度50℃、加酶量8 000 U/g、底物濃度5.0%、pH 9.5。在此條件下進行酶解，所得得到羥基自由基清除率為50.98%。

對酶解制備的抗氧化肽進行活性研究，考察了·OH、DPPH以及ABTS自由基清除率、Fe2+螯合能力和總還原能力5個指標。結果表明，榛子抗氧化肽隨著濃度的升高，對Fe2+螯合率最高能夠達到99.3%，對·OH、ABTS的清除率及DPPH的清除率能夠達到100%。由此可見榛子抗氧化肽對幾種自由基有顯著的清除作用，具有較強的抗氧化活性，是一種良好的天然抗氧化劑，擁有廣闊的研究價值和市場前景。

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Preparation and Activity of Antioxidant Peptide from Hazelnut in Changbai Mountain

LI Jing-jing1，2，SUN Wen-jia1，2，MIN Wei-hong1，2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing，Changchun 130118，Jilin，China）

In this experiment，hazelnut nut protein isolated was used as raw material，hydrolyzed by Alcalase to prepare antioxidant peptide.Through Box-Behnken method，the optimal hydrolysis conditions were determined as hydrolysis temperature of 50℃，Alcalase concentration of 8 000 U/g，substrate concentration of 5.0%，hydrolysis pH of 9.5.Assess the antioxidant potential，with the increasing of the peptide solution concentration，scavenging capacities against ABTS and DPPH were 100%at 4 mg/mL，scavenging capacities against hydroxyl radical and reducing power were 85.46%and 0.859 at 8 mg/mL，Ferrous ions chelating capacity of hazelnut antioxidant peptide was 99.3%at 12 mg/mL.

hazelnut protein isolated；antioxidant peptide；enzymatic hydrolysis optimization；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.001

國家“863”計劃項目（2013AA102206）

李京京（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品科學。
*

閔偉紅（1971—），女，教授，博士生導師，主要從事發酵工程、糧油科學與深加工技術研究。

2015-01-22