降煙堿解淀粉芽孢桿菌和邊緣假單胞菌原生質體融合選育高效降煙堿菌株

鄧高毅，彭 宇，王遠亮（.湖南農業大學食品科技學院/食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 408；.湖南中煙技術中心，湖南 長沙 4004）

降煙堿解淀粉芽孢桿菌和邊緣假單胞菌原生質體融合選育高效降煙堿菌株

鄧高毅1，彭 宇2，王遠亮1
（1.湖南農業大學食品科技學院/食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南中煙技術中心，湖南 長沙 410014）

獲取1株高效降解煙堿的融合子，以解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌作為親本菌株，使用溶菌酶破除親株細胞壁后以40%PEG-6000誘導解淀粉芽孢桿菌T11原生質體和已熱力滅活的邊緣假單胞菌原生質體進行融合，并檢測了融合子的降煙堿能力。對融合子利用青霉素抗性初篩獲得了176株再生融合子，利用煙堿降解率為指標進行降煙堿復篩實驗后獲得5株煙堿降解能力較高的融合子。根據融合子遺傳穩定性分析及與親本菌株煙堿降解效率的對比，獲得了1株煙堿降解率比親本菌株更強的融合子A2。獲得的高效降解融合子A2在第5天后其煙堿降解率基本穩定在93%。

解淀粉芽孢桿菌T11；邊緣假單胞菌；原生質體；融合子；煙堿

鄧高毅，彭宇，王遠亮.降煙堿解淀粉芽孢桿菌和邊緣假單胞菌原生質體融合選育高效降煙堿菌株［J］.廣東農業科學，2016，43 （6）：143-148.

煙堿含量是評價煙葉品質好壞的重要指標之一。烤煙的煙堿含量一般要求在1.5%～3.5%，然而近年研究發現，我國部分地區種植的煙草煙堿含量偏高，特別是煙草上部煙葉，有的煙堿平均含量在4%以上［1-2］，這不僅嚴重影響了煙葉品質，而且過高的煙堿含量會對廣大吸煙者的神經產生更強的刺激作用，進而危害身心健康。傳統種植工藝通過改善種植條件或采用優化打頂技術等手段，以期降低煙草中過高的煙堿含量，但是效果不佳［3-4］。

利用微生物降低煙草中過高的煙堿含量既經濟又環保。國內外學者已從煙草生長環境中分離出多種具有降煙堿能力的微生物，且國外在利用微生物降解煙葉煙堿方面已開展了大量的基礎和應用研究［5-7］，如Newton等［8］使用假單胞菌菌液降解煙絲中的煙堿，18 h后煙絲煙堿含量由2.0%下降至0.8%。目前國內對微生物應用于降解煙堿研究起步較晚且缺乏系統連續性的研究［9］。

本試驗前期已從健康煙葉和煙草種植土壤中分離得到1株降煙堿解淀粉芽孢桿菌T11和1株邊緣假單胞菌，其煙堿降解率分別為80.6%、76.3%［11-12］，擬利用原生質體融合技術進一步提高其煙堿降解能力。原生質體融合是指通過人為操作的方法，將遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體進行融合，以此獲得兼有雙親遺傳性狀的穩定重組子的一種基因重組技術。這種技術打破了微生物的種界界限，不僅在種內、種間，而且在親緣很遠的兩個物種之間都可能進行融合，能擴大融合頻率和幅度，是一種常見的微生物育種方法。原生質體融合與常規雜交相比有很多優勢，不但能顯著提高重組頻率，而且具有定向育種的含義，目前該技術已成為細胞生物學迅速發展的方向之一［10］。因此，本研究以解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌為親本菌株進行原生質體融合，以期選育高效降解煙堿的融合子。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 降煙堿細菌 解淀粉芽孢桿菌T11（對青霉素敏感），由本實驗室從煙葉內部分離、鑒定及保存［11］；邊緣假單胞菌（可抗青霉素），由本實驗室從煙草土壤中分離、鑒定及保存［12］。

1.1.2 試劑及培養基 （1）液體完全培養基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，氯化鈉10 g，水1 000 mL，pH7.0，添加2%瓊脂即為固體完全培養基。

（2）高滲液體再生培養基：于（1）中加入0.5 mol/L蔗糖，調節pH值至7.0，100～115℃滅菌15 min，溫度過高易使蔗糖發生焦糖化反應，添加2%瓊脂即為高滲固體再生培養基。

（3）高滲融合子固體篩選培養基：于（2）中加入青霉素，使其終濃度為100 U/mL。

（4）原生質體穩定液（SMM）：0.5 mol/L蔗糖，0.02 mol/L氯化鎂，0.02 mol/L順丁烯二酸，使用Tris緩沖液配制，調節pH值至6.5。

（5）0.01 mol/L Tris緩沖液，調pH值至6.5。

（6）高滲Tris緩沖液：于（5）中加入0.5 mol/L蔗糖，0.01 mol/L氯化鈣。

（7）6 U/mL青霉素溶液：生理鹽水配制，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

（8）4 mg/mL甘氨酸溶液：蒸餾水配制，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

（9） 0.1 mol/L EDTA溶液：蒸餾水配制，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

（10）4 mg/mL溶菌酶液：SMM配制，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

（11）促融合劑PEG液：40%PEG-6000，使用（6）液配制，120℃滅菌21 min。

（12）液體煙堿培養基：0.5 mL微量溶液（0.4 g MnSO4·7H2O，0.2 g CaC12·2H2O，0.2 g FeSO4·7H2O，用0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL），1 g煙堿，13.3 g K2HPO4·3H20，4 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，蒸餾水定容至1 000 mL［13］。添加2%瓊脂粉即為固體煙堿培養基。

1.1.3 主要儀器設備 分析天平（湘儀天平有限公司）、DK-BD型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）、SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、GZX250型生化培養箱（天津瑪福爾生化培養）、TDL-5000bR型冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）、紫外可見光分光光度計（日本島津有限公司）、OLMPUS顯微鏡、AJ50585型微量移液器（法國）、手持精密pH計（美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙堿含量的測定 取2 mL液體煙堿發酵液于10 000 r/min下離心10 min，取上清液0.25 mL 于50 mL 容量瓶中，用0.05 mol/L鹽酸定容，搖勻。以不加入煙堿的發酵液液作為空白對照，于259 nm波長下測各發酵液中煙堿的吸光值［14］。并依據煙堿標準曲線換算出煙堿含量，計算液體煙堿發酵液中煙堿的降解率。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌T11原生質體的制備 制備解淀粉芽孢桿菌T11生長曲線，按制備生長曲線的條件培養其至對數生長前期，加入終濃度為6 U/mL的青霉素溶液和4 mg/mL的甘氨酸溶液后培養至對數生長后期，7 000 r/min離心5 min，棄上清液，使用Tris緩沖液洗滌菌體3次，懸浮于9 mL預熱至35℃高滲Tris緩沖液中，添加預熱至35℃的溶菌酶溶液使其終濃度為4 mg/mL，置于恒溫水浴鍋中35℃保溫酶解，30 min后取樣鏡檢觀察破壁情況，每隔10 min取樣鏡檢觀察，當絕大部分菌體破壁形成原生質體時離心，停止酶解，棄上清后使用高滲Tris緩沖液洗滌3次，將原生質體懸浮于SMM中并置于冰箱保存、備用。原生質體形成率、再生率的計算參照文獻［15］進行。

1.2.3 邊緣假單胞菌原生質體的制備 制備邊緣假單胞菌的生長曲線，按制備生長曲線的條件培養其至對數生長后期，7 000 r/min離心5 min，棄上清液，使用Tris緩沖液洗滌菌體3次，懸浮于9 mL的預熱至35℃高滲Tris緩沖液中，加入用高滲Tris緩沖液配制并預熱至35℃的EDTA，使其終濃度為0.1 mol/L，添加預熱至35℃的溶菌酶溶液使其終濃度為4 mg/mL，置于恒溫水浴鍋中35℃保溫酶解，30 min后取樣鏡檢觀察破壁情況，每隔10 min取樣鏡檢觀察，適時停止酶解，離心棄上清后使用高滲Tris緩沖液洗滌菌體3次，將原生質體懸浮于SMM中并置于冰箱保存、備用。原生質體形成率、再生率的計算參照文獻［15］進行。

1.2.4 邊緣假單胞菌原生質體的熱力滅活 取若干管同等數量級（5 mL/管，濃度為109cfu/mL）保存于冰箱的邊緣假單胞菌原生質體懸液轉移至50 mL的三角瓶中，置于65℃恒溫水浴鍋中分別保溫0、5、10、15、20、25、30、35、40 min 后，各取100 μL菌液涂布于高滲固體再生培養基上，培養5～7 d，計算再生菌落數。以熱力滅活時間為橫坐標、滅活率為縱坐標作熱力滅活曲線。

熱力滅活率（%）=（滅活前每100 μL菌液涂布后的菌落數-滅活后每100 μL菌液涂布后的菌落數）/滅活前每100 μL菌液涂布后的菌落數×100

1.2.5 PEG-6000誘導原生質體融合及融合子的再生、篩選 取解淀粉芽孢桿菌T11（對青霉素敏感）原生質體和已經熱力滅活的邊緣假單胞菌（可抗青霉素）原生質體懸液各1 mL，小心混勻后于4℃、3 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，加入40%PEG促融劑1 mL，于35℃恒溫水浴鍋中保溫促融3 min。于4℃、3 000 r/min下再次離心10 min，棄上清，使用SMM穩定液經10倍系列稀釋后各取100 μL涂布于高滲融合子固體篩選培養基上，35℃培養2～3 d，觀察并計算菌落總數及融合率。因為邊緣假單胞菌可抗青霉素，而解淀粉芽孢桿菌T11對青霉素極其敏感，所以只有當已被熱力滅活的邊緣假單胞菌原生質體和解淀粉芽孢桿菌T11原生質體發生了真正的融合，才能在高滲融合子固體篩選培養基上生長。

融合率（%）=滅活后高滲融合子固體篩選培養基上平均菌落數（個/100 μL ）/滅活前再生培養基上平均菌落數（個/100 μL）×100

1.2.6 融合子降煙堿能力的遺傳穩定性 將篩選得到的融合子全部轉接至煙堿固體培養基中，35℃培養3～5 d，對能在煙堿固體培養基上生長出來的融合菌株進行降煙堿能力檢測。挑取降煙堿能力最強的5個融合子進行傳代試驗，傳接10代并測定每次傳代后其降煙堿能力，操作方法為每次挑取1環菌體加入到5 mL液體煙堿培養基（煙堿濃度為1 g/L）中，5 d后于10 000 r/min下離心10 min，根據1.2.1方法測出煙堿降解率。

1.2.7 融合子與親株間降煙堿能力的比較 選取降煙堿能力且遺傳穩定性最好的融合子菌株與出發菌株解淀粉芽孢桿菌T11、邊緣假單胞菌進行降煙堿能力的檢測與對比。

1.3 數據處理

采用Origin8.0軟件對試驗數據進行統計、作圖分析。

2 結果與分析

2.1 煙堿標準曲線

按照煙堿標準曲線的制作方法配制一系列濃度的煙堿標準溶液，波長259 nm下測定其吸光度值，以煙堿濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，使用Origin8.0軟件作煙堿標準曲線，如圖1所示。

圖1 煙堿濃度與吸光度標準曲線

2.2 解淀粉芽孢桿菌T11與邊緣假單胞菌的生長曲線

解淀粉芽孢桿菌T11及邊緣假單胞菌接種培養后，于13 h之前每隔1 h在波長600 nm下測定吸光度值，13 h后每隔2 h測定1次，使用Origin8.0軟件作生長曲線，如圖2所示。

圖2 解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌的生長曲線

微生物的生長階段分為遲緩期、對數生長期、穩定期和衰亡期，每個階段的菌體對環境的敏感度存在較大差別。對于細菌而言，處于對數生長后期的菌體，其細胞壁更容易被溶菌酶破壞結構而達到破壁的效果，此時原生質體的制備率更高，而處于其他生長階段的菌體細胞壁對溶菌酶的敏感性較差。由圖2可看出，解淀粉芽孢桿菌T11在接種4 h后進入對數生長前期，11 h開始進入穩定期；而邊緣假單胞菌則是接種3 h后進入對數生長前期，11 h達到穩定期。因此，試驗選擇解淀粉芽孢桿菌T11在接種5 h時（對數生長前期）加入青霉素及甘氨酸后繼續培養至對數生長后期（10 h時），邊緣假單胞菌培養至10 h時取出離心制備原生質體。

2.3 酶解時間對原生質體形成率和再生率的影響

酶解時間對解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌原生質體的形成率、再生率的影響如圖3所示。對于解淀粉芽孢桿菌T11而言，其原生質體形成率隨酶解時間的增加而升高，而再生率則在酶解時間為60 min后急劇下降，當酶解時間為90 min時形成率雖然達到了最大值98.7%，可再生率卻由酶解時間為60 min時的83.7%下降到40.5%，導致再生率下降的原因是隨著時間的推移解淀粉芽孢桿菌T11原生質體脫水較為嚴重，從而失去了再生能力。邊緣假單胞菌于酶解60 min前，原生質體形成率和再生率均呈上升趨勢，分別達到了68.2%和62.3%，而再生率緊接著出現了大幅度下降，在90 min時下降至30.1%。綜合考慮上述影響因素，解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌細胞壁的最佳酶解時間均應控制在60 min。

圖3 酶解時間對原生質體形成率和再生率的影響

2.4 邊緣假單胞菌原生質體熱滅活對滅活率的影響

原生質體熱力滅活只是使邊緣假單胞菌原生質體失去單獨存活于再生培養基上的能力，但其染色體仍然保留復制及與其他原生質體染色體重組等能力［16］。試驗表明，保溫溫度為60℃時，邊緣假單胞菌原生質體的滅活率在5～20 min之間由10.3%增至92%，在25 min時滅活率達到100%。因此，邊緣假單胞菌原生質體的滅活試驗時間選擇為25 min。

2.5 PEG-6000促融時間對融合率的影響

試驗以40%PEG-6000為促融劑、45℃下誘導解淀粉芽孢桿菌T11和已熱力滅活的邊緣假單胞菌原生質體進行融合。在不同促融時間下測定了原生質體的融合率，結果表明，促融時間1、2、3、5、7、9 min時，融合率分別為2.4×10-6、3.9×10-6、4.7×10-6、3.5×10-6、2.2×10-6、6.7×10-7?？梢姡偃跁r間1～3 min之間，融合率呈增長趨勢，3 min時達最大值4.7×10-6，但隨著促融時間的延長原生質體的融合率反而下降，9 min比7 min時的融合率降低了一個數量級。這說明在較短的時間內（1～3 min）PEG-6000起到了較好的促融效果，但由于PEG-6000的存在對原生質體具有較大毒性作用［17］，時間過長反而不利于融合子的再生。因此，促融時間以3 min為宜。

2.6 融合子遺傳穩定性的檢測

經初步篩選，共獲得了176株再生融合子，利用煙堿選擇性培養基進一步復篩，得到5株降煙堿能力較強的融合子。對降煙堿能力最強的5個融合子進行傳代試驗，分別標記為融合子A1、A2、A3、A4、A5，每個融合子每次傳代后檢測降煙堿能力，均設置3個平行試驗，分析結果見表1。經單因素方差分析（表2），融合子A1、A3、A4、A5不同世代對煙堿降解率的差異極顯著，而融合子A2不同世代對煙堿降解率的差異不顯著，即其煙堿降解率的穩定性好。從表1可以看出，第1代融合子A1、A3、A5的煙堿降解率分別為94%、93.8%和95.7%，均高于第1代融合子A2的92.1%煙堿降解率。但是除了融合子A1第4代的93.2%菌株煙堿降解率略高于相應代數融合子A2的91.8%煙堿降解率外，融合子A1、A3、A5后續傳代的菌株煙堿降解率均低于融合子A2相應代數的菌株煙堿降解率。從表2可以看出，融合子A2連續傳10代的煙堿降解率較為穩定。融合子A4的第1代菌株煙堿降解率僅為90%，傳至第10代時已降至77.2%，故也不適合作為理想降煙堿的融合子。綜上，選擇A2作為理想的降煙堿融合子進行后續試驗。

表1 融合子煙堿降解率（%）遺傳穩定性分析結果

表2 融合子煙堿降解率遺傳穩定性的方差分析

圖4 融合子A2與親株降煙堿能力的對比

2.7 融合子A2與親株降煙堿能力的對比

將融合子A2與解淀粉芽孢桿菌T11、邊緣假單胞菌進行降煙堿能力檢測，通過7 d連續降解來對比其降煙堿的效果。每個菌株設置3個平行試驗，每天分別測定不同菌株的降煙堿效率，取其均值作圖（圖4）。從圖4可以看出，融合子A2在1～7 d之間的煙堿降解率均高于相應降解天數的解淀粉芽孢桿菌T11、邊緣假單胞菌的煙堿降解率。第5天融合子A2、解淀粉芽孢桿菌T11及邊緣假單胞菌的煙堿降解率分別為92.9%、74.27% 和73.73%，第6天、第7天各菌株煙堿降解率與第5天的煙堿降解率基本持平，融合子A2的煙堿降率基本維持在93%左右。這說明融合子A2的降解率雖然最高，但未能完全降解煙堿培養基中的煙堿，這可能是因為某種中間代謝產物達到了一定的濃度后會抑制融合子A2降煙堿關鍵酶的酶活性。經方差分析，第1～5天3種菌株煙堿降解率隨時間變化的差異極顯著，融合子A2煙堿降解率比解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌強。而相同條件下重復融合子A2、解淀粉芽孢桿菌T11和邊緣假單胞菌降煙堿能力測定試驗3次，它們最終的煙堿降解率差異不顯著，這說明融合子A2煙堿降解能力比親株強是具有統計學意義的。

3 結論與討論

本試驗結果表明，利用40%PEG-6000誘導單親滅活的邊緣假單胞桿菌和解淀粉芽孢桿菌T11原生質體進行融合是可行的，經穩定性遺傳分析得到1株穩定降解煙堿的融合子A2，其在第5 天后的煙堿降解率達到92.9%，降煙堿能力比親株高10%，為進一步研究提高微生物降煙堿能力提供基礎方法，為構建應用于大田降解煙葉中含量偏高的煙堿提供技術基礎。此外，還可應用此高效降煙堿融合子降解煙草廢棄物中的煙堿，以降低煙堿對環境的污染，應用價值較大。

國內外已分離得到多種能夠降解煙堿的微生物。張娟等［14］分離得到的摩氏摩根氏菌（細菌）發酵14 d后才降解了相同濃度下87.51%的煙堿，降解效率明顯比本研究得到的融合菌株低。丁懷宇等［18］使用除蟲鏈霉菌（放線菌）處理白肋煙煙片，煙堿降解率為74.77%，該放線菌是從煙片上分離得到的，具有更能適應存活于煙葉上的遺傳特性，本試驗獲取的融合子A2融合了存活于煙草中兩種細菌的遺傳特性，因此具有較大優勢，有望將其直接降解大田煙葉中含量過高的煙堿。Raman等［19］分離得到了1株降煙堿變形假單胞菌TND35，并對其發酵代謝物進行了研究，發現了新的煙堿降解途徑。本研究的融合子A2遺傳了親株的部分遺傳特性，但其降解煙堿的具體中間代謝物還需進一步的研究。

目前，國內采用原生質體融合等傳統成熟的生物技術手段進一步提高降煙堿能力的研究鮮有報道。因此，利用生物技術獲取高效降解煙堿新資源的研究有待深入研究，以加快其運用到煙草大田中去解決煙葉煙堿含量過高的問題。對于未來應用融合子去降解煙葉中的煙堿，需要評價其是否會對煙葉品質造成影響，因此對融合子A2的煙堿降解途徑也有待進一步研究探討。

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（責任編輯 崔建勛）

Protoplast fusion between nicotine-degrading Bacillus amyloliquefaciens and Pseudomonas marginalis to breed efficient nornicotine strain

DENG Gao-yi1，PENG Yu2，WANG Yuan-liang1
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University/Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China；2.Technology Center of China Tobacco Hunan Industrial Co.Ltd.，Changsha 410014，China）

In order to acquire fusant with high nicotine-degrading ability，Bacillus amyloliquefaciens T11 and Pseudomonas marginalis were used for parent strains.After using lysozyme to break the cell walls of parent strains，the Bacillus amyloliquefaciens T11 protoplast and heat-inactivated Pseudomonas marginalis protoplast were induced by 40% PEG-6000 for protoplast fusion experiment，then the nicotine-degrading ability of fusant was measured.Through preliminary screening，176 fusion strains were obtained.After rescreening by nicotine selective culture medium，5 fusion strains with higher nicotine-degrading ability were acquired.Genetic stability analysis of the 5 fusion strains and comparision with parent strains’ nicotine-degrading rate were further measured.A better fusant A2 with higher nicotinededrading ability than parent strains was obtained finally，93% nicotine in culture medium was degraded in five days.

Bacillus amyloliquefaciens T11；Pseudomonas marginalis；protoplast；fusant；nicotine

S182

A

1004-874X（2016）06-0143-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.06.025

2015-11-18

湖南中煙工業有限責任公司（KY2012Y C0001）

鄧高毅（1989-），男，在讀碩士生，E-mail∶610715556@qq.com

王遠亮（1976-），男，博士，教授，E-mail∶408083310@qq.com