五華三黃雞MHC-B區域復合微衛星位點LEI0258遺傳多樣性與進化研究

黃勛和，張金楓，譚坤鳳，李麗芝，李威娜，鐘福生

（嘉應學院生命科學學院，廣東 梅州 514015）

五華三黃雞MHC-B區域復合微衛星位點LEI0258遺傳多樣性與進化研究

黃勛和，張金楓，譚坤鳳，李麗芝，李威娜，鐘福生

（嘉應學院生命科學學院，廣東 梅州 514015）

應用MHC-B區域復合微衛星位點LEI0258研究五華三黃雞的遺傳多樣性與進化地位。147份樣品共檢測到48個等位基因，長度范圍為181～495 bp。等位基因251（0.0952）、275（0.0850）和310 （0.0816）頻率最高。DNA測序鑒定出44個等位基因，其中42個為首次發現。觀察雜合度、期望雜合度和多態信息含量分別為0.830、0.927和0.952。9個等位基因與15種已知MHC血清型相匹配。基于側翼區變異信息的中介網絡圖將44個等位基因分為7個進化枝，其中3個進化枝存在于紅原雞中，提示五華三黃雞起源于紅原雞。研究結果表明，微衛星LEI0258適用于雞群體遺傳多樣性、血清型鑒定和進化研究。

多態性；主要組織相容性復合體；LEI0258；五華三黃雞；進化；血清學

黃勛和，張金楓，譚坤鳳，等.五華三黃雞MHC-B區域復合微衛星位點LEI0258遺傳多樣性與進化研究［J］.廣東農業科學，2016，43（6）：163-168.

主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）是基因組編碼細胞免疫相關蛋白的基因。雞MHC位于16號染色體上，由兩個獨立的 B區和Y區組成［1］。B區對宿主許多傳染性疾病（如馬可氏病）的抗性或易感性等有關［2］。傳統采用血清學的方法對MHC進行分型，但由于不同群體的血清型存在較大差異，該技術難以廣泛推廣［3-4］。而位于B區的微衛星位點LEI0258被認為與血清型顯著關聯后［5-6］，涌現出一系列基于LEI0258多態性、進化與免疫的研究，豐富了LEI0258的基礎理論，加強了對生產實踐的指導作用［7-12］。

五華三黃雞是原產于廣東省梅州市五華縣的優良小型肉用地方品種［13］。由于外來品種的大量引進和自身生長速度慢、繁殖性能較低等缺點，目前五華三黃雞只少量分布于五華縣的邊遠山區。為了科學保護和合理利用五華三黃雞，近年來開展了資源調查、品種特性、保種選育、遺傳資源與進化等研究，取得了一定的成果［14-19］，但抗病相關的基礎研究尚屬空白。本研究利用微衛星位點LEI0258分析五華三黃雞的遺傳多樣性，探討LEI0258等位基因與MHC血清型的關系，進一步了解LEI0258的進化動態，為五華三黃雞保種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料共147份樣品，來源于五華三黃雞原產地五華縣棉洋、安流、龍村、硝芳、周江、梅林和譚下7個鄉鎮偏遠山區農戶自孵自養的無明顯親緣關系的個體，采集時間為2012年10月至2013年11月，樣品類型為背部帶羽髓羽毛。基因組DNA采用試劑盒HiPure Tissue DNA Mini Kit （美基生物，廣州）提取，-20℃保存備用。

1.2 PCR擴增與基因分型

微衛星位點LEI0258使用引物LEI0258F：5' -CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG-3' 和LEI0258R：5' -AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC-3' 擴增［6］。正向引物5' 端添加了熒光標記FAM。PCR反應體系為20 μL，含10×PCR buffer 2μL，dNTP mixture （2.5 mmol/L）1.6 μL，引物（20 μmol/L）各0.2μL，rTaq DNA聚合酶（Takara，大連）1 U，DNA模板50 ng。擴增條件為94℃預變性4 min；94℃變性30 s、63℃退火1 min、72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后在ABI 3730分析儀上進行基因型判定，基因分型工作由無錫翼和應用生物技術有限公司完成。

1.3 微衛星測序

基于基因分型結果，每個等位基因挑選1個以上樣品進行測序。具體挑選原則為：如果等位基因只為1個樣品所有，只挑選該樣品進行測序；如果等位基因為多個樣品所共有，則挑選不同鄉鎮的樣品進行測序。待測樣品PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，割膠回收需要測序的片段，連接T載體（Takara，大連），然后轉入大腸桿菌DH5α，在LB培養基中進行過夜培養，再使用LEI0258引物進行PCR鑒定，最后送廣州艾基生物技術有限公司進行雙向測序。

1.4 數據分析

等位基因數（NA）、觀察雜合度（HO）、期望雜合度（HE）和多態信息含量（PIC）通過軟件Cervus 3.0.3［20］計算。序列由軟件BioEdit［21］編輯處理，并輔以人工校驗。微衛星側翼序列用于多態性分析，同時使用軟件SplitsTree 4.10構建中介網絡圖（median-joining network）［22］。

2 結果與分析

2.1 LEI0258基因型多態性

147份樣品共檢測到48個等位基因，長度范圍為181～495 bp。其中251頻率最高（0.0952），其次是275（0.0850）、310（0.0816）和495 （0.0782），多個等位基因只出現1次（表1）。在樣品量接近的情況下，不同等位基因在不同群體中出現的頻率不盡相同，例如205和251在周江群體多于梅林群體，495在譚下群體多于其他群體。有些等位基因只出現在某個群體中，例如206、261 和334只分布于譚下群體中，217、336、372、407 和425僅分布于梅林群體中。

五華三黃雞群體微衛星LEI0258遺傳變異水平見表2。在五華三黃雞7個群體中，HO均明顯低于HE，說明可能存在空位點。但HE、HO和PIC均高于0.8，高于先前的微衛星研究［18］，表明五華三黃雞保持著較高的遺傳變異水平。

2.2 LEI0258核苷酸多態性

挑選 1 2 1個片段進行 D N A測序，獲得44個等位基因，片段長度從182～489 bp不等，其中42個是首次發現（表3）。大部分測序鑒定的等位基因長度要小于基因分型的結果，只有等位基因182、193、194、205、206和217與測序結果一致（表 3）。LEI0258有兩個重復單元R13（CTATGTCTTCTTT）和R12 （CTTTCCTTCTTT），重復次數分別為1～18和2～27，呈現此消彼長的關系。重復區上游有77 bp（包括引物序列），下游75 bp。上游發現6個變異位點，以轉換為主，-29、-30出現“TT”缺失的現象。下游發現4個變異位點，以顛換為主。下游11～18“ATTTTGAG”的多態現象與Han等［9］和Chazara等［10］的報道相同，但與Fulton等［5］報道的“ATTTGAGG”不一致。9個等位基因（194、205、295、309、345、381、393、420、443）對應于15種血清型，分別是B1、B5、B6、B10、B13.1、B13.2、B14、B17、B24、B26、B34、B62、B76、BW3 和BW11（表3）。

表1 五華三黃雞群體微衛星LEI0258等位基因頻率

表2 五華三黃雞群體微衛星LEI0258的遺傳變異分析

表3 五華三黃雞微衛星LEI0258位點等位基因多態性

2.3 LEI0258側翼區中介網絡圖分析

去掉微衛星LEI0258重復區后，基于側翼區的變異信息構建中介網絡圖（圖1）。44個等位基因分為7個進化枝（A～G），每個進化枝含1～23個等位基因，B、C和F只有1個等位基因，D則有17個，而R13大于1的等位基因全部在進化枝D中。進化枝A、D和G同樣存在于紅原雞中。

圖1 基于五華三黃雞LEI0258位點側翼區變異信息的中介網絡圖

3 結論與討論

本研究結果表明，五華三黃雞微衛星位點LEI0258顯示出極高的多態性，與該群體的遺傳資源現狀相符，說明LEI0258適用于評估雞群體遺傳多樣性水平。同時LEI0258與MHC血清型顯著關聯，通過研究LEI0258單倍型，可快速鑒定血清型，降低研究成本和提高效率。

3.1 LEI0258多態性

本研究獲得五華三黃雞微衛星位點LEI0258等位基因44個，其中42個未在其他群體發現［5，8-10］。Han等［9］發現了21個LEI0258的新等位基因，等位基因489只存在于中國地方雞群體中，稀有等位基因可作為鑒定雞品種和監測雞群體保護動態的依據。本研究發現的新等位基因可能是五華三黃雞群體所特有的，可作為品種鑒定的潛在分子標記，但需要進一步確認。

五華三黃雞LEI0258表現出極高的多態性（HO＞0.83，PIC＞0.95），高于許多地方雞種如會寧雞、靜寧雞、絲羽烏骨雞和商品雞［10，12］。五華三黃雞其他微衛星研究同樣表現出高多態性［18］，說明該品種仍保留著較高的遺傳多樣性，具有很大的保護潛力與利用價值，這得益于五華三黃雞封閉的自然環境和飼養模式。因此，微衛星位點LEI0258可作為研究雞群體遺傳多樣性的候選分子標記。

3.2 LEI0258與血清型

MHC血清型類型的豐富程度與疾病抵抗能力正相關［7，23-24］。由于可獲得的血清型信息有限，并且五華三黃雞新發現的等位基因較多，許多等位基因的血清型無法確定。9個等位基因與15種已知血清型相對應，這些血清型大部分來源于白來航雞，并且已在其他雞群體中得到驗證［5，9，24］。剩余35個等位基因對應的血清型尚未鑒定，因此將來需要開展五華三黃雞MHC血清型鑒定工作，從而為抗病研究提供理論依據。

3.3 LEI0258與進化

LEI0258是非典型性的微衛星位點，由兩個重復單元R13和R12組成，兩者不同的組合形成了不同的等位基因。同時側翼區存在大量的插入缺失（indels）和堿基突變（SNPs），表現出極高的多態性［5，7-12］。目前NCBI數據庫上LEI0258等位基因有80個，加上本研究新發現的42個，共122個，遠高于其他微衛星位點。由于側翼區的變異速率低于重復區，因而側翼區的變異信息可作為劃分等位基因的依據。然而，盡管會出現片段長度和重復單元相同而被劃分為不同的等位基因的現象，但Chazara等［10］指出中介網絡圖更多反映的是等位基因之間的關系，而非系統發生關系。同時，E 等［11］鑒定出LEI0258在-30～43之間存在重組現象，可能在MHC的進化過程中發揮重要的作用。因為MHC處于與抗病能力密切相關編碼區，無疑會受到選擇的壓力，因而LEI0258也可能處于選擇和進化動態中［11］。

中介網絡圖將44個等位基因分為7個進化枝，重復單元R13大于1的等位基因全部分布在進化枝D中。進化枝A、D和G存在于紅原雞中，說明五華三黃雞可能起源于紅原雞，與線粒體基因組的研究結論相一致［17］。

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（責任編輯 崔建勛）

Diversity and evolution of the highly tandem repeat LEI0258 with in MHC-B region in Wuhua three-yellow chicken

HUANG Xun-he，ZHANG Jin-feng，TAN Kun-feng，LI Li-zhi，LI Wei-na，ZHONG Fu-sheng
（School of Life Sciences，Jiaying University，Meizhou 514015，China）

To investigate the polymorphism and evolution of Wuhua three-yellow chicken，the tandem repeat LEI0258 located within the B region of chicken major histocompatibility complex （MHC-B region） was applied.A total of 48 alleles ranging from 181 to 495 bp in 147 samples were found.Three alleles，251 （0.095），275 （0.0850），and 310 （0.0816） were the most frequency in this breed.Forty-two of 44 alleles defined by DNA sequencing was novel for Wuhua three-yellow chicken.The LEI0258 showed high levels of polymorphism，with 0.830，0.927 and 0.952 for observed heterozygosity，expected heterozygosity and polymorphic information content，respectively.Nine alleles were corresponding to 15 available serotypes.The 44 alleles were classified into seven clusters，based on the SNPs and indels found within the sequences flanking the repeats，of which three was also found in red fowl jungle，indicating that Wuhua three-yellow chicken was of origin from red fowl jungle.The results presented herein suggested that LEI0258 could be used as a candidate molecular marker for uncover genetic diversity，serology and evolution in chicken.

polymorphism；major histocompatibility complex；LEI0258；Wuhua three-yellow chicken；evolution；serology

S831.2；Q346+5

A

1004-874X（2016）06-0163-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.06.028

2016-03-20

廣東省自然科學基金（2014A03030 7018）；嘉應學院“創新強校工程”項目（CQX019）；廣東省公益研究與能力建設項目（2015A020208020，2016A030303068）；嘉應學院重點科技計劃項目（2015KJM03）

黃勛和（1982-），男，博士，講師，E-mail：hxh826@126.com

鐘福生（1958-），男，博士，教授，E-mail：zfs@jyu.edu.cn