分子標記輔助選擇聚合水稻抗蟲抗病基因育種研究進展

李玉營，李聲春，李曉方，2

（1.長江大學農學院，湖北 荊州 434025；2.廣州南國農業有限公司，廣東 廣州 510800）

分子標記輔助選擇聚合水稻抗蟲抗病基因育種研究進展

李玉營1，李聲春1，李曉方1，2

（1.長江大學農學院，湖北 荊州 434025；2.廣州南國農業有限公司，廣東 廣州 510800）

褐飛虱、白葉枯病和稻瘟病是水稻生產中的主要病蟲害，一旦發生會造成水稻大幅度減產。分子標記輔助選擇相對于傳統育種，可大大縮短育種年限，提高育種效率。將多個抗性基因聚合到同一材料中，可提高水稻對病蟲害的綜合抗性。總結了水稻主要抗病蟲基因的研究和利用現狀，綜述了分子標記輔助選擇在水稻抗病蟲育種方面的應用、研究進展及目前所面臨的困難。

褐飛虱；白葉枯病；稻瘟病；分子標記輔助選擇；基因聚合

李玉營，李聲春，李曉方，等.分子標記輔助選擇聚合水稻抗蟲抗病基因育種研究進展［J］.廣東農業科學，2016，43（6）：119-126.

水稻是世界主要糧食作物之一，也是我國第一大糧食作物，中國有65%的人以大米為主食［1-2］。然而褐飛虱、白葉枯病和稻瘟病是水稻的主要病蟲害，每年都會造成大量的產量損失［3］，是農民種植面臨的主要問題。目前針對水稻病蟲害的防治主要是化學手段，化學防治可以很大程度減輕病蟲害的危害，但會增加成本且污染環境，長時間的使用化學物質也會導致新的變異小種的產生，給病蟲害的防治帶來更大的挑戰。生產實踐表明，培育并種植水稻抗性品種是控制病蟲害最經濟、環保和有效的方法［4］。傳統育種是通過表現型對基因型進行間接選擇，這種選擇方法的結果易受微效多基因、遺傳背景、環境和發育時期等因素的影響［5］，因此選擇效率較低，且年限較長。分子標記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）是通過與目的基因緊密連鎖或共分離的分子標記，對目的基因進行篩選，因而不受環境條件的影響，增加了選擇的可靠性［6］。利用分子標記輔助選擇將抗性基因轉入遺傳背景較好的水稻材料中，可明顯改良該材料對病蟲害的抗性。聚合不同類型的多個抗病蟲基因到同一材料中，可以提高材料的抗病等級、拓寬抗譜，是水稻抗病蟲品種培育的發展方向。將多個抗性基因聚合到同一品種中，其抗譜增加并不是單個基因的抗譜之間的簡單累加，而是基因之間表現為極顯著互作［5］。而且眾多研究表明，聚合多個抗性基因能明顯提高品種的抗性水平和持久性［7］。本文主要綜述了水稻褐飛虱、白葉枯病和稻瘟病基因的發掘現狀，及目前分子標記輔助選擇聚合水稻抗性基因的研究進展。

1 褐飛虱研究進展

褐飛虱（Nilaparvata lugens）屬同翅目飛虱科昆蟲，僅取食稻，是我國及亞洲稻區重要蟲害之一［8-9］。褐飛虱是典型的吸食維管束液的昆蟲［10］，它不僅會影響水稻中營養物質的運輸，而且還存在傳播草狀矮縮病（grassy stunt virus）、高低矮縮病（rugged stunt virus），以及通過產卵器劃破穗頸產卵等危害［11-12］，造成植株生長緩慢，產量下降。嚴重時引起飛虱“火燒”，稻田成片枯萎，造成嚴重減產甚至絕收［13］。褐飛虱對亞洲稻區影響很大，在栽培抗稻褐飛虱品種面積較大的地區，一旦產生變異，對水稻生產將構成嚴重威脅［14］。因此研究褐飛虱抗性基因及其抗性育種意義重大。

1.1 褐飛虱基因的研究現狀

目前，已發現和報道的水稻抗褐飛虱基因達到28個，已有24個主效抗性基因被定位［15-16］，僅有Bph14被成功克隆［17］，此外還鑒定了一些重要的抗性QTLs，各基因所在染色體見表1［16，18-20］。 bph5、bph7、bph8、bph24（t） 4個基因尚未定位。其中Bph3和bph4抗譜較廣，可抗生物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型；bph8、Bph9、Bph10、Bph12 （t）、Bph14、Bph15抗生物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。

表1 水稻抗褐飛虱基因在染色體上分布情況

Bph14是水稻中第一個被克隆的抗蟲基因，它在水稻苗期和成熟期都表現抗性，在根、葉片和葉鞘的維管束即褐飛虱的攝食部位表達，降低了褐飛虱的取食、生長速率和壽命［16-17］。梁云濤等利用攜有Bph18（t）基因抗褐飛虱材料與感蟲材料之間在抗蟲位點上的單核苷酸差異分析，成功開發出1個STS標記KC1，并通過研究得出結論KC1標記對目的基因有較高的選擇效率，可以應用于揚稻6號遺傳背景下Bph18（t）基因的分子標記輔助選擇［21］。Yongfu Qiu等利用9311和秈稻B14的F2群體，將bph12基因定位到水稻第4染色體RM16459-RM1305間1.9cM的范圍內，并構建了一個包含bph12座位的以日本晴（感BPH）為背景的近等基因系，通過與攜帶Bph6的NIL雜交，建立了攜帶有兩個基因的聚合株系，并證明了不同BPH抗性基因的聚合產生了更強的對BPH蟲的拒趨作用和抗生作用［18］。 Huang等利用高分辨率的遺傳連鎖分析，對Bph27進行定位，最終將其定位在日本晴基因組一個86.3kb的區間內［22］。Yasumori Tamura等對Bph26進行圖位克隆，發現Bph26和Bph2是同一個基因，Bph2對其中一種亞洲褐飛虱抗性較差，但與其它抗性基因聚合可獲得更為持久廣泛的抗性［20］。

1.2 分子標記輔助選擇技術在水稻抗褐飛虱育種中的應用

隨著分子標記輔助選擇技術的發展，水稻聚合育種也取得很大進步，不少育種家和研究者運用此技術將褐飛虱抗性基因轉到其他品種中或聚合多個抗性基因，大大提高了品種的抗性。李進波等以抗褐飛虱材料B5和優良雜交稻9311及1826為親本，通過復交和回交，運用MAS技術對Bph14 和Bph15進行鑒定選擇，最終得到一系列目標基因純合且農藝性狀優良的穩定株系，并證明利用與Bph14 和Bph15 緊密連鎖的分子標記開展抗褐飛虱分子標記輔助選擇育種是一種有效的育種途徑［13］。劉開雨等將抗稻褐飛虱基因Bph3和Bph24 （t）分別導入主栽雜交水稻恢復系廣恢998、9311、R15、明恢63、R29中，獲得多份含抗性基因的材料，其中Bph24（t）導入系對稻褐飛虱抗性略強于Bph3導入系；Bph3、Bph24（t）聚合系的抗性最強，因此抗性基因聚合對稻褐飛虱的抗性具有基因累加效應［23］。Jie Hu等將Bph14和Bph15轉到明恢63中，分別得到了含有單抗性基因和雙抗性基因的材料，均較大提高了水稻對褐飛虱的抗性，其中雙抗性基因的材料與單抗性基因材料相比，表現出更強的抗性［24］。Jie Hu等將Bph14、Bph15和Bph18導入9311及其雜交種中，結合表型鑒定，得出基因的抗性效應大小順序為14/15/1 8 ≥ 14/15 ＞ 15/18 ≥ 15 ＞ 14/18 ≥ 14 ≥ 18 ＞無抗性基因材料，而且田間數據表明，導入抗性基因材料的產量與對照相當甚至更高［25］。胡巍等利用MAS和回交育種，將Bph3、Bhp14和Bph15分別導入到華南高產水稻品種桂農占中，獲得了多個含抗性基因的穩定株系，且各株系的農藝性狀和產量性狀與桂農占均沒有顯著差異［26］。

表2 水稻抗白葉枯病基因在染色體上分布情況

2 白葉枯病研究進展

水稻白葉枯病是由黃單胞桿菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）引起的，是水稻最嚴重的細菌性病害之一，水稻感染白葉枯病以后一般減產20%～30%，嚴重的可減產50%，甚至顆粒無收，目前已成為一種全球性的水稻病害［5，27-28］。早稻秧苗感染白葉枯病病菌后往往不表現癥狀，成為帶菌苗，晚稻在三四葉期就可表現癥狀。白葉枯病的傳播主要是靠植株傷口、水孔和葉鞘及葉鞘基部的變態氣孔。

2.1 白葉枯病基因的研究現狀

目前，經國際注冊確認和期刊報道的水稻白葉枯病抗性基因共38個，其中26個為顯性基因，12個為隱性基因；已被定位的抗性基因有26個，其中Xa1［29］、xa5［30］、xa13［31］、Xa21［32］、Xa23［33］、Xa26［34］、Xa27［35］等7個基因已成功克隆，各基因在染色體上的分布見表2［36］。由表2可知，除12個未定位基因外，11號染色體上的抗白葉枯病基因最多，達10個；Xa7、xa8、Xa11、Xa12、xa15、Xa16、Xa17等17個基因屬于成抗基因，其中顯性基因11個，隱性基因6個。Xa21是第一個從野生稻中被克隆出來的重要功能基因，在分蘗后期表達抗性，因其廣譜的抗性而受到廣泛關注，Xa21 編碼產物是一個由1 025個氨基酸組成的類受體蛋白激酶，主要有幾個典型的結構域，即LRR 區、跨膜區、激酶區等［37］，Xa21在剛發現時具有較廣的抗譜，但隨著它在抗病育種中的廣泛應用，致使新的致病小種出現，例如攜帶Xa21的水稻材料IRBB21對廣東的白葉枯病小種Ⅳ、Ⅴ型均表現不抗［38］。Xa21雖然已研究較為深入，但仍有一些問題待解決，如Xa21對Xoo抗性的具體調控網絡，Xa21是否還存在其他的結合蛋白靶標等［28］。Xa23是另一個被認為抗白葉枯病較好的基因，它是迄今已知基因中抗譜最廣、抗性導入效應很強的一個完全顯性的全生育期抗性基因［39］。Xa23 于1998年由章琦等鑒定，2011年經國際水稻新基因命名委員會正式命名為Xa23，不少學者也對其進行了深入的研究，2003年潘海軍等利用SSR標記和RAPD標記，將Xa23 定位于水稻第11染色體長臂上SSR標記RM206和RAPD標記RpdH5之間，遺傳距離分別為1.9cM和7.0cM［40］；2005年王春連等利用EST標記，將Xa23定位在第11染色體上C189和CP02662之間，遺傳距離分別為0.8cM和1.3cM，并將C189成功用于水稻分子育種實踐，標記輔助選擇的正確率接近100%［41］；2014年Chunlian Wang等對Xa23做了精細遺傳圖譜，并開發了6個與Xa23位點共分離或緊密連鎖的新的STS標記Lj36、Lj46、Lj138、Lj74、A83B4和Lj13，最終將Xa23基因定位于標記Lj138和A83B4之間0.4cM的區域內，并鑒定該基因在該區域與標記Lj74共分離，LOC_Os11g37620是Xa23基因最有可能的候選基因，這些結果均有利于在水稻育種中對Xa23進行分子標記輔助選擇，也有利于一些有價值的抗性基因的分子克隆［42］。

2.2 分子標記輔助選擇技術在水稻抗白葉枯病育種中的應用

近幾年人們對白葉枯病的研究較多，不僅培育出許多攜帶單抗基因的品種，也培育出了很多含有多個抗性基因的新品種。Zhang等運用MAS技術將Xa7和Xa21聚合到明恢63中，大大提高了明恢63及其雜交種對白葉枯病的抗性［43］。曹立勇等利用分子標記輔助選擇技術培育出國稻6號，通過了國家和重慶市審定，并大面積推廣［44］；鄭家團等利用常規雜交育種技術和MAS技術，快速獲得了12份具有Xa23基因的穩定恢復系材料，采用白葉枯病菌株的專化強毒菌系P6對所得材料進行室內接種鑒定，篩選出1份高抗白葉枯病的抗性新恢復系材料［45］。Yanchang Luo等將Xa4、Xa21和Xa27基因導入綿恢725或9311為背景的恢復系，并通過2個株系的雜交將3個抗性基因疊加，最終構建一個帶有Xa4、Xa21和Xa27的新恢復系（XH2431）［46］。閆成業等將白葉枯病抗性基因Xa7、Xa21和螟蟲抗性基因cry1C*聚合到水稻恢復系先恢207中，育成了2個攜帶Xa7+Xa21+cry1C*基因的改良恢復系株系，并且農藝性狀和產量表現均較好［47］；Jung-Pil Suh等將Xa4、xa5、Xa21聚合到同一水稻材料中，結果表明含有3個抗性基因的材料對水稻白葉枯病的抗性明顯強于僅含有1個或2個抗性基因的材料，而且這些抗性基因對水稻的農藝性狀沒有不良影響［48］。楊德衛等利用MAS技術將Xa23導入優良早稻恢復系中，通過田間鑒定篩選出7份抗白葉枯病的優良恢復系材料［49］。

3 稻瘟病研究進展

稻瘟病在水稻整個生育期內都可能發生，因此根據發病時期和發病部位，可分為苗瘟、葉瘟、穗瘟、節瘟和谷粒瘟［50］，而其中尤以穗頸瘟對產量影響最為嚴重。稻瘟病是一種世界性稻作病害，全球每年因稻瘟病造成的水稻產量損失達11%～30%，嚴重的可達 50%以上，局部田塊甚至顆粒無收，中國稻瘟病的年發生面積均在380萬hm2以上，每年因稻瘟病危害損失稻谷 2億～10 億kg［51-52］。稻瘟病分布范圍廣，造成的危害大，是目前水稻生產中亟需解決的問題之一［53］。實踐證明，培育與種植抗病品種是最經濟有效的防治稻瘟病措施。然而，大多抗病品種推廣數年后抗性會逐步喪失，其主要原因是大面積種植的品種往往抗病基因相對單一，使得稻瘟病菌群體中的毒性小種逐漸成為優勢小種，造成病害流行。因此選育持久抗病品種是育種工作者一貫追求的目標［52］。

3.1 稻瘟病基因的研究現狀

目前，至少有69個抗稻瘟病位點共84個主效基因已被定位，這些基因成簇地分布于除第3 染色體外的所有水稻染色體上，各基因所在染色體情況見表3，其中有pi21和pi55（t）為隱性基因，其他為顯性基因，已有Pb1、Pi-a、Pi-b、Pi-d2、Pi-d3、Pi-k、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p、Pi-sh、Pi-t、Pi-ta、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、pi21、Pi25、Pi36、Pi37、Pi56（t）、Pi63、Pi-CO39等24個基因被成功克隆［54］。由表3可知，大部分基因分布在第6、11和12號染色體上，出現了較多基因等位、復等位的情況，如Pi-a和Pi-CO39等位，Pid3 與Pi25 等位，Pi-ta2 與Pi-ta 等位，Pi22（t）可能和Pi2等位，Pi26可能與Pi-z等位，Pi1、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p同為Pik位點上的復等位基因，Pi2、Pi9、Pi50、Pigm、Piz、Piz-t同為Piz 位點上的復等位基因等；另外還有基因連鎖的情況，如Pi-sh 和Pi-t連鎖，Pi15和Pi5/Pi3/Pi-i緊密連鎖或等位，Pi-19和Pi-ta2緊密連鎖或等位等。

3.2 分子標記輔助選擇技術在水稻抗稻瘟病育種中的應用

稻瘟病的抗性基因較多，生理小種也較多，分子標記輔助選擇技術在水稻稻瘟病育種中也取得較多成果。Haichao Jiang等通過分子標記選擇的方法將基因Pi1，Pi2，和D12 導入到金23B及其衍生的雜交稻中，結果表明金23B及其雜交水稻中所包含的抗性基因越多，則其對稻瘟病的抗性越強［55］；肖武名等通過回交、自交和分子標記輔助選擇，將抗病基因Pi46（t）轉育到強恢復系廣恢998中，并在第四代自交群體中選出較好的單株R1198，結果表明R1198比廣恢998的抗譜明顯拓寬［56］；閆成業等采用雜交、回交和MAS技術將廣譜抗性基因Pi9滲入到Q優6號的父母本中，得到的雜交后代在保持產量、生育期、稻米品質和主要農藝性狀相似的基礎上，明顯提高稻瘟病抗性，降低生產風險［57］。涂詩航等將稻瘟病抗性基因Pi25導入保持系福稻B中，并通過多次回交檢測，最終獲得具有良好稻瘟病抗性和不育性的水稻材料［58］。張薈等以含Pi9的水稻材料為供體，與4個優良恢復系雜交、回交、復合雜交，并運用MAS技術培育了多個抗稻瘟病的水稻新恢復系［59］。杜太宗等運用MAS技術將抗稻瘟病基因Pi1、Pi9導入水稻保持系金23B中，大大提高了其稻瘟病抗性水平，且雙抗性基因材料的抗性提高更加顯著［60］。

表3 水稻抗稻瘟病基因在染色體上的分布情況

4 分子標記輔助選擇在水稻多種病蟲害抗性基因聚合上的應用

含有單一水稻抗病蟲基因材料的抗性仍有局限性，長時間和大面積的推廣易導致其抗性的降低或喪失，因此將針對多種病蟲害的多抗性基因聚合到同一材料中，不僅可以增強材料對水稻病蟲害抗性的廣譜性和持久性，減少化學藥物施用量，降低對環境的影響，而且可以提高水稻產量，改善品質。陽海寧等將基因Xa23和Bph3分別導入主栽雜交水稻品種的保持系中，獲得雙抗性基因聚合系144份，接種結果表明，具有單一抗性基因的株系與同時含有兩個目的基因的抗性水平相當而且農藝性狀與受體材料相比差異不顯著［61］；胡杰等利用分子標記輔助選擇將水稻抗褐飛虱基因Bph14、Bph15和抗稻瘟病基因Pi1、Pi2同時導入珍汕97B中，使其同時獲得褐飛虱和稻瘟病抗性，田間鑒定結果表明，改良雜交稻的褐飛虱和稻瘟病抗性均顯著提高［62］；毛鐘警等利用MAS技術將水稻抗白葉枯病基因Xa23和抗褐飛虱基因bph20（t）聚合到同一材料中，并獲得純合株系，培育出具有抗白葉枯病和褐飛虱雙抗基因的個體，為水稻育種提供抗性材料［63］；趙鵬等利用常規育種、MAS和抗病蟲鑒定相結合的手段，將抗稻褐飛虱基因bph20（t）和bph21（t）及高抗稻瘟病基因Pi9聚合到優良保持系博ⅢB中，篩選獲得5份聚合褐飛虱抗性基因（bph20和bph21）和抗稻瘟病基因Pi9的抗或高抗水稻中間材料，為選育新的雙抗保持系和不育系提供了種質材料［64］；潘曉飚等利用MAS和田間鑒定選擇相結合的方法，將三黃占2號的抗稻瘟病主基因Pi-GD-1（t）、Pi-GD-2（t）和主效QTL GLP8-6（t）及抗白葉枯病基因Xa23導入到明恢86、蜀恢527和浙恢7954等3個骨干中秈恢復系中，通過復交進行基因聚合，獲得5個帶有抗稻瘟病兼抗白葉枯病的雙基因或多基因聚合系，結果表明，抗稻瘟病基因和抗白葉枯基因Xa23在不同恢復系背景下的抗性表達完全，對恢復系稻瘟病以及白葉枯病改良的效果明顯［65］；田大剛等將Pi9和Xa23導入到3個新育成的水稻恢復系中，明顯提高了改良恢復系對稻瘟病和白葉枯的抗性，且農藝性狀與原材料無明顯差異［66］；樓玨等（2016）將抗稻瘟病基因Pi-GD-1（t）、Pi-GD-2（t），抗白葉枯病基因Xa23和抗褐飛虱基因Bph18（t）導入3個中秈恢復系中，獲得了8個多抗性基因聚合系，大大改良了原恢復系的綜合抗性［67］。

5 分子標記輔助選擇聚合水稻抗蟲抗病基因育種的展望

目前發現的水稻病蟲抗性基因的抗譜相對狹窄，因此抗譜較廣、抗性較強的資源有待于進一步挖掘；然而抗性較好的新型資源一般在野生材料中發現，這些材料常常會含有較多的不利基因，有些甚至與目標抗性基因連鎖，通過常規的方法很難打破連鎖，在利用這些資源時會對原來的優良材料產生影響，而通過連續回交有可能導致目標抗性基因的丟失［14］，因此有些較好的抗性基因在育種中利用率較低。在現有發掘的抗性基因里，有些尚未精確定位，選擇時效率較低，但隨著越來越多的水稻SSR標記被開發，將有助于解決因分子標記與目標基因較遠而造成基因型與表型不一致的問題［68］，使選擇的結果更加準確。

當前水稻分子標記輔助選擇育種主要集中在少數主效基因的利用上，而大部分基因并未得到應用，而且在數量性狀方面的應用也相對較少。研究發現稻瘟病的抗性是由多基因控制的數量性狀，而對于數量性狀的定位目前還有很大難度，現有的分子標記選擇技術對多位點多基因的選擇相對困難［50］。受主效基因控制的含有單一抗性基因的品種在大面積推廣之后，由于致病菌和害蟲的變異，很快會使原有的抗性降低甚至喪失，且易導致新的生理小種的產生，因此抗性主效基因與微效多基因結合，以及多個主效基因聚合育種將成為水稻分子育種的主要方向；將多個抗性基因聚合到同一材料中不僅可以提高其抗性的廣譜性和持久性，而且有可能降低因新的生理小種的產生而帶來的損失，但是在聚合同一抗性或不同抗性多個基因時，并不一定越多越好，隨著聚合基因數目的增加，不良性狀的連鎖累贅也可能增加［69］，聚合材料的農藝性狀、產量性狀是否受到影響，以及抗性水平是否顯著提高，仍需要通過表型進行驗證。

分子標記輔助選擇為水稻抗病蟲育種提供了一個簡便的途徑，相對于表型鑒定，從分子水平確定材料中是否含有所需的目的基因，既準確又可靠，有利于縮短育種年限，通過分子選擇與表型鑒定相結合，減輕了育種工作量，同時也增加了結果的可信性，因此分子標記輔助選擇技術將在水稻育種中得到廣泛的發展與應用。但MAS在水稻育種上仍有一定的局限度，一方面一些MAS育種的技術參數仍知之較少，如每個世代中應檢測和保留的個體數，以及是采用單個標記還是雙個標記基因等問題［70］；另一方面，MAS育種需要對每個基因進行選擇，如果聚合多個抗性基因，需要利用與每個抗性基因緊密連鎖的分子標記對其進行選擇，工作量會大大增加。因此在育種中需要優化分子設計，優先選擇功能性標記，當選擇標記距離目的基因較遠時可采用雙標記的方法提高選擇效率，另外可嘗試使用多重PCR技術或基因芯片技術，但成本也會相應增加［5］，所以仍需尋找一種簡單、成本較低的方法來解決目前限制多基因聚合育種的問題。

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（責任編輯 楊賢智）

Research progress of molecular marker-assisted selection for pyramiding disease and insect resistance genes in rice

LI Yu-ying1，LI Sheng-chun1，LI Xiao-fang1，2
（1.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，China；2.Guangzhou Nanguo Agriculture Ltd.，Guangzhou 510800，China）

The rice yield decreases greatly because of the brown planthopper，bacterial blight or blast occur，which are major pest and diseases in rice.The combination of marker-assisted selection with traditional breeding technology could enhance breeding efficiency.The resistance against diseases and insect pests of rice could be improved significantly when multiple resistance genes were pyramided to one material.The application，research progress and difficulties of molecular marker-assisted selection in rice breeding were introduced .

brown planthopper；bacterial blight；rice blast；marker-assisted selection（MAS）；gene pyramiding

S511.034

A

1004-874X（2016）06-0119-08

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.06.021

2016-02-11

國家科技支撐計劃項目（2014BAD 01B04）

李玉營（1993-），男，在讀碩士生，E-mail：liyuying930421@163.com

李曉方（1962-），女，博士，教授，E-mail：lixiaofang35@126.com