當歸補血湯超濾物對大鼠心肌細胞線粒體凋亡通路的影響

劉　凱　許茸茸　孫少伯　朱貝貝　高　瑛　李應東

(蘭州大學基礎醫學院，甘肅　蘭州　730000)

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當歸補血湯超濾物對大鼠心肌細胞線粒體凋亡通路的影響

劉凱1許茸茸孫少伯1朱貝貝1高瑛2李應東1

(蘭州大學基礎醫學院，甘肅蘭州730000)

〔摘要〕目的探討當歸補血湯超濾膜提取物對大鼠心肌細胞線粒體凋亡通路的影響。方法原代培養Wistar大鼠乳鼠心肌細胞，阿霉素誘導心肌細胞凋亡。實驗分正常組、阿霉素組(2.5 mg/L)、當歸補血湯超濾膜提取物低、中、高劑量干預組(阿霉素造模前，預先給予含30,60,120 mg/L當歸補血湯超濾膜提取物完全培養基培養2 h)。MTT法檢測各組細胞存活率,熒光顯微鏡下各組細胞凋亡形態學觀察，激光共聚焦技術測定各組心肌細胞線粒體膜電位水平，蛋白印跡法測定各組Bax，Bcl-2,Caspase-3蛋白表達水平。結果與正常組相比，阿霉素組心肌細胞存活數明顯降低，可見細胞凋亡及線粒體膜電位降低；Bcl-2蛋白表達水平下降，Bax、Caspase-3表達水平升高(P<0.05)；與阿霉素組比較，當歸補血湯超濾膜提取物干預組的心肌細胞存活數明顯升高，凋亡細胞數目減少，線粒體膜電位升高，Bax、Caspase-3表達水平下調，Bcl-2蛋白表達水平上調(P<0.05)。結論線粒體凋亡通路的激活是阿霉素誘導心肌細胞凋亡的機制之一，當歸補血湯超濾膜提取物可調控該通路發揮心肌細胞保護作用。

〔關鍵詞〕當歸補血湯超濾膜提取物;心肌細胞；線粒體；凋亡

線粒體凋亡通路是調控細胞凋亡的重要信號通路之一。阿霉素(ADR)是一種高效廣譜的蒽環類抗腫瘤藥物，但其可誘導心肌細胞凋亡，有心臟毒性，使其臨床應用受到一定限制〔1，2〕。當歸補血湯為益氣補血名方，其當歸與黃芪1∶5配伍，本實驗藥物選用甘肅道地藥材多序巖黃芪與岷當歸，經超濾膜技術截留0～100 000分子量成分〔3〕。前期實驗結果提示〔4～6〕：當歸補血湯超濾膜提取物對氧化損傷致心肌細胞凋亡具有抑制作用，對ADR造成的心肌細胞損傷有抑制作用，但線粒體凋亡通路在其中的變化情況少有研究。本文探討線粒體凋亡通路在ADR誘導心肌細胞凋亡過程中的變化及當歸補血湯超濾膜提取物對其影響。

1材料與方法

1.1實驗藥物當歸補血湯超濾物由甘肅中醫學院、甘肅省膜科所、蘭州佛慈制藥廠、蘭州太保制藥有限公司聯合制備。當歸、多序巖黃芪飲片按1∶5比例混合，水煎煮兩次，過濾雜質后加熱濃縮，陶瓷膜微濾濃縮液(技術參數為壓力0.5 kPa/m3，流量100 L·h-1·m-2，溫度25℃)，選用中空纖維超濾膜(截留相對分子量為1×105PNA)，超濾經微濾處理的當歸補血湯濃縮液(技術參數為膜面積0.25 m2，過濾能力2～30 L/h，系統壓力≤5.0 bar)，將超濾液噴霧干燥成粉，相對生藥材的得率為0.89%。藥物成分多糖39.9%，皂苷3.5%，其他56.6%。高效液相檢測指紋圖譜進行質控。

1.2動物新生Wistar大鼠，1～3日齡，甘肅中醫學院SPF級動物實驗中心提供，生產許可證號：SCXK(甘)2013-0001，合格證號:0001018。

1.3試劑和儀器DMEM培養基、胎牛血清、膠原酶(Ⅱ型)、胰蛋白酶：GIBCO公司產品；5-溴脫氧尿嘧啶、碘化丙啶(PI)、四氮唑藍(MTT)、羅丹明123(Rh123)、二甲基亞砜(DMSO)、雙苯并咪唑(Hoechst 33342)：Sigma公司產品；ADR：山西普德藥業股份有限公司，批號：1103E3；兔抗鼠β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG：武漢博士德公司； PVDF膜：上海信然生物科技有限公司；ECL 化學發光試劑盒：碧云天公司產品；2406-2型二氧化碳培養箱：美國SHELLAB產品 ；SW-CJ-1FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；酶聯免疫檢測儀(m680)：北京元業伯樂科技發展有限公司；FV1000激光共聚焦顯微鏡：日本Olympus公司產品；凝膠成像分析系統(AlPhalmager2200型)：美國AIPha公司產品。

1.4方法

1.4.1心肌細胞原代提取培養參照文獻〔7〕，取新生1～3 d的Wistar大鼠,麻醉處死，無菌條件迅速取出心臟，4℃PBS清洗2遍，剔除附屬物留心尖組織，將其剪成約1～3 mm3大小組織塊，加入0.04%胰蛋白酶消化，37℃水浴振蕩10 min，共2次，棄去消化液，用0.05%膠原酶(Ⅱ型)消化，37℃水浴振蕩8 min，多次消化至組織塊消化完全。收集每次消化液，加等量含15%胎牛血清完全培養基終止消化，1 000 r/min，離心10 min，用含15%胎牛血清完全培養基混懸消化下來的細胞，置于細胞培養箱(37℃，5%CO2)中培養。采用差速貼壁法與5-溴脫氧尿苷化學方法純化細胞，調整細胞濃度1×106個/ml，于細胞培養箱中繼續培養。每隔36 h換液 1 次，細胞經培養72 h 后進行實驗。

1.4.2實驗分組實驗分5組：正常組(預先給予與藥物組含等量生理鹽水的完全培養基培養2 h后，更換培養基，加入與ADR等量的生理鹽水)，ADR組(預先給予與藥物組含等量生理鹽水的完全培養基培養2 h后，更換培養基，加入ADR，調整其終濃度為2.5 mg/L)，當歸補血湯超濾物低、中、高劑量干預組(分別預先給予含300,600,1 200 mg/L歸補血湯超濾物超濾膜提取物完全培養基培養2 h后，更換培養基，各組樣本培養基中加入ADR，調整其終濃度為2.5 mg/L)，繼續培養24 h 后行指標檢測。

1.4.3 細胞活性測定96孔板培養心肌細胞貼壁，加10 μl/孔MTT(5 mg/L)培養4 h后，加150 μl/孔DMSO，震蕩10 min，490 nm酶標儀測各孔吸光度值(OD值)。所測OD值可定量反映活細胞數量。生長抑制率=(對照組OD值-干預組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4.4凋亡形態學觀察〔8〕用盛有蓋玻片的六孔板培養心肌細胞(密度1.5×105ml)，待細胞爬片，造模，PBS漂洗心肌細胞，加300 μl/孔Hoechst33342(5 mg/L)染色后，避光放置30 min，PBS漂洗2次，將細胞爬片反置于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察細胞形態變化并拍照。

1.4.5線粒體膜電位(Δφm)檢測〔9～13〕將心肌細胞接種于共聚焦顯微鏡專用培養皿中(密度1.5×105ml)，造模，PBS漂洗心肌細胞，加10 μl/皿 Rh123染液(終濃度為10 mg/L)，孵育10 min，PBS漂洗2次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內Rh123的熒光強度變化，激發波長488～505 nm，發射波長530 nm。每組6樣本，每樣本隨機取3個視野觀測拍照，細胞內熒光積分光密度值/熒光區域面積(IOD/Area)應用Image Pro-Plus 6.0軟件分析。

1.4.6蛋白檢測〔14,15〕收集各組心肌細胞，4℃PBS漂洗2遍,裂解細胞提取蛋白質,考馬斯亮藍法繪制標準曲線，測定蛋白濃度。每組各取50 μl蛋白量經SDS PAGE電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加Bax，Bcl-2，Caspase-3，β-actin抗體4℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG于37℃孵育1 h,加ECL發光試劑孵育1 min,暗室將膜在感光膠片上曝光，加顯影液，定影液洗像。Bax 、Bcl-2、Caspase-3分子量約為22 kD、26 kD、32 kD。用Alpha Imager2200圖像分析系統進行灰度掃描,計算 Bax，Bcl-2，Caspase-3與β-actin灰度比值。

1.5統計學方法應用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析及q檢驗。

2結果

2.1不同濃度ADR對心肌細胞活性的影響采用MTT法檢測ADR終濃度為1.25、2.50、5.0、10.0 mg/L，在12、24 h下對原代培養乳鼠心肌細胞生長的抑制作用，正常組加等體積生理鹽水。實驗選擇ADR作用于心肌細胞12、24 h對其生長均有明顯抑制作用(P<0.05)；2.5 mg/L ADR作用于心肌細胞24 h抑制率達52.17%，構建心肌細胞凋亡模型。見表1。

2.2不同濃度當歸補血湯超濾膜提取物對心肌細胞活性的影響不同濃度當歸補血湯超濾膜提取物預處理心肌細胞2 h,更換不含藥物的完全培養基繼續培養24 h,于預處理2 h后及繼續培養24 h后分別測定各組MTT值，正常組加等體積生理鹽水，結果見表2。與正常組比較，預處理2 h后各藥物組心肌細胞的OD值無明顯差異(P>0.05)；與正常組細胞比較，預處理心肌細胞2 h后,更換不含藥物的完全培養基繼續培養24 h,各藥物組心肌細胞的OD值出現顯著差異(P<0.05)，各藥物組呈現出一定促心肌細胞增殖作用。依據結果選定300、600、1 200 mg/L作用于心肌細胞進行下一步實驗。見表2。

表1　不同濃度ADR對心肌細胞的凋亡作用

與0.00 mg/L劑量組比較：1)P<0.05，下表同

2.3當歸補血湯超濾膜提取物對ADR誘導的心肌細胞損傷的抑制作用與正常組比較，ADR組心肌細胞的OD值降低顯著(P<0.05)，說明造模成功。與ADR組相比，各劑量當歸補血湯超濾膜提取物干預組心肌細胞的OD值明顯上升(P<0.05)。見表3。各組細胞經Hoechst33342染色后(圖1)，與正常組比較，ADR組胞核呈高度濃染的凋亡細胞較多，與ADR組比較，當歸補血湯超濾膜提取物預處理組的凋亡細胞數目明顯減少。

2.4各組心肌細胞Δφm與正常組比較，ADR組細胞內Rh123 熒光明顯減弱，心肌細胞Δφm降低(P<0.05)；與ADR組比較，當歸補血湯超濾膜提取物干預組心肌細胞內Rh123熒光增強，細胞Δφm 升高(P<0.05)。見表3，圖2。

表2　當歸補血湯超濾膜提取物不同濃度作用心肌細胞不同時間MTT值

表3　各組心肌細胞抑制率、線粒體膜電位Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達及Bcl-2/Bax比值

與正常組比較：1)P<0.05；與ADR組比較:2)P<0.05

圖1　各組心肌細胞凋亡的形態學觀察(×200)

圖2　線粒體膜電位圖(×400)

2.5各組心肌細胞Bax，Bcl-2，Caspase-3蛋白表達及Bcl-2/Bax比值變化與正常組相比，ADR組心肌細胞中Bax、Caspase-3蛋白的表達量明顯增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達量明顯下降(P<0.05)，Bcl-2/Bax的比值降低(P<0.05)。與ADR組比較，高劑量和中劑量干預組細胞中Bax，Caspase-3蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著增加(P<0.05)， Bcl-2/Bax比值有一定升高(P<0.05)。見表3、圖3。

1.正常組；2.ADR組；3.低劑量干預組；4.中劑量干預組；5.高劑量干預組高劑量干預組圖3　各組心圖3　各組心肌細胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達情況

3討論

在線粒體凋亡通路中，損傷刺激會誘導細胞Bax發生構象變化，通過暴露TM域易位到線粒體外膜上，同時暴露BH3域和疏水區在線粒體外膜上齊聚形成脂質孔，脂質孔的形成致使線粒體膜通透性增加，膜電位崩解，引起膜間隙蛋白細胞色素C釋放進入細胞質，細胞色素C、Apaf1、dATP形成凋亡小體，凋亡小體激活線粒體凋亡通路下游的Caspase家族起動因子Caspase-9，活化的Caspase-9激活下游執行者Caspase-3，最終導致細胞凋亡的發生〔16～19〕。在線粒體凋亡通路中，Bcl-2家族的抗凋亡與促凋亡蛋白通過形成異源二聚體并定位于線粒體外膜上發揮作用，在維持線粒體膜的完整性，維持正常的線粒體跨膜電位，抑制線粒體膜間隙蛋白細胞色素C的釋放有重要意義，Bcl-2/Bax比值降低細胞趨向凋亡，Bcl-2/Bax比值升高細胞趨向存活〔20〕。當歸補血湯是益氣生血的經典方，研究表明當歸補血湯對心肌細胞的保護作用確切，可以提高心肌細胞的代謝和補償能力〔4，21〕。本實驗說明ADR成功誘導了心肌細胞的凋亡，線粒體凋亡通路的激活是ADR誘導心肌細胞凋亡的機制之一，當歸補血湯超濾膜提取物可調控其通路發揮心肌細胞保護作用。黃芪、當歸是中醫益氣、補血的常用藥物。當歸補血湯中重用黃芪，其具有益氣升陽,益衛固表等功效，當歸為血中氣藥，具有活血補血之功，兩藥合用補氣生血之力強，氣旺則血生，陽生則陰長。線粒體是細胞產生能量的場所，是調節細胞凋亡的中心，中醫氣血理論與其密切相關，本實驗結果提示益氣生血藥物對線粒體功能有積極調控作用，可以對抗ADR對心肌細胞線粒體結構與功能的破壞。

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〔2014-03-13修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

基金項目：甘肅省中醫藥科研課題(No.07-gzk-31)

通訊作者：李應東(1962-)，男，醫學博士，博士生導師，教授，主要從事中西醫結合防治內科常見病研究。

〔中圖分類號〕R259

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3115-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.010

1甘肅中醫藥大學2蘭州太保制藥有限公司

第一作者：劉凱(1974-)，男，在讀博士，副教授，副主任醫師，主要從事中西醫結合防治內科常見病研究。