U PLC-D A D檢測減肥類中藥制劑及保健食品中的4種非法添加成分

涂鳳蓮汪元符

（1南昌市新建區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，江西 南昌 330100；2南昌市食品藥品檢驗所，330038）

U PLC-D A D檢測減肥類中藥制劑及保健食品中的4種非法添加成分

涂鳳蓮1汪元符2

（1南昌市新建區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，江西 南昌 330100；2南昌市食品藥品檢驗所，330038）

目的：針對減肥類中藥制劑及保健食品，建立了可能非法添加的酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明等4種成分的超高效液相色譜-二極管陣列聯(lián)用的檢測方法。方法：采用Phenomenex Luna C18（2）100A色譜柱（150 mm×2.00 mm，3 μm），流動相為磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L磷酸氫二鉀以磷酸調(diào)節(jié)pH值為6.0）及甲醇，梯度洗脫，柱溫為35℃，流速為0.2 mL/min，進樣量為5.0 μL，檢測器為DAD檢測器。結(jié)果：各成分檢出限濃度為30 ng/mL，定量限濃度為50 ng/mL，線性范圍為50～1 000 ng/mL，在線性范圍內(nèi)相關系數(shù)均在0.99以上，平均加樣回收率在96.0%～ 101.2%。結(jié)論：建立的方法簡便、快速、準確、靈敏度高、專屬性好，用于減肥類中藥制劑及保健食品中非法添加的快速檢測優(yōu)于現(xiàn)行法規(guī)標準所列的高效液相色譜法。

超高效液相色譜-二極管陣列；減肥類中藥制劑及保健食品；酚酞；西布曲明；N-單去甲基西布曲明；N，N-雙去甲基西布曲明；非法添加

在食品藥品監(jiān)督管理部門日常的監(jiān)督抽檢、風險監(jiān)測及投訴舉報受理的工作中，減肥類中藥制劑及保健食品非法添加違禁藥物成分的情況時有發(fā)生，嚴重危害著人民群眾的身體健康及生命安全。現(xiàn)行法規(guī)標準［1］在檢測此類非法添加時，采用先行薄層色譜初篩，再行高效液相色譜法定性及定量，最后液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用確證的方法。在實際的檢測工作中，發(fā)現(xiàn)其中的高效液相色譜法存在著一定的缺陷，可能造成檢測靈敏度降低或假陰性、漏檢的結(jié)果。基于科學、公正、準確、高效的宗旨，為提高檢測方法的靈敏度、準確度、精確度，本實驗室建立了以下有效的超高效液相色譜-二極管陣列檢測的方法，能夠滿足平時的監(jiān)督檢驗需要。

1儀器、試劑與材料

Agilent 1290高效液相色譜儀（使用 DAD檢測器），METTLER TOLEDO ME204E電子分析天平，METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，昆山KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，TG16-WS臺式高速離心機（湘儀離心機），Millipore超純水系統(tǒng)。

甲醇（色譜純，Merck），乙腈（色譜純，Merck），冰乙酸（色譜純，麥克林A801303-500 mL），乙酸銨（優(yōu)級純，麥克林 A800998-500 g），磷酸（分析純，麥克林 P816337-500 mL），磷酸氫二鉀（分析純，麥克林P816382-500 g）。

對照品：酚酞（100091-199601），鹽酸西布曲明（100624-200401）、鹽酸N-單去甲基西布曲明（520002-201301）、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明（520001-201301），均購自中國食品藥品檢定研究院。

樣品：購自流通或醫(yī)療機構(gòu)。中藥制劑8批：體美減肥膠囊（規(guī)格：0.3 g，批號：130607），福瑞堂輕身減肥膠囊（規(guī)格：0.35 g，批號：131005），靚爾娜輕身減肥片（規(guī)格：108片，批號：130722），永孜堂降脂減肥片（規(guī)格：36片，批號：130301），堂旨舒降脂減肥片（規(guī)格：72片，批號：130722），形美輕身減肥片（規(guī)格：48片，批號：131015），同仁堂輕身消胖丸（規(guī)格：240粒，每100粒約重15 g，批號：130705），中一牌防風通圣丸（規(guī)格：6 g，批號：130701）。保健食品12批：輕身樂減肥膠囊（規(guī)格：0.20 g，批號：14070301）蜀寶減肥膠囊（規(guī)格：200 mg，批號：20150310），紐斯葆婷采減肥靚顏膠囊（規(guī)格：0.3 g，批號：FC158），美澳健秀中秀減肥膠囊（規(guī)格：0.4 g，批號：15202002），金奧力綠茶肉堿膠囊（規(guī)格：0.42 g，批號：14041901），康乃馨殼聚糖左旋肉堿荷葉片（0.7 g，批號：150401），奧斯萊康惠普生纖纖片（規(guī)格：600 mg，批號：20150301），湯臣倍健左旋肉堿茶多酚荷葉片（規(guī)格：1 220 mg，批號：20140514A），紐斯葆綠荷片（規(guī)格：0.4 g，批號：EC678），碧生源減肥茶（規(guī)格：2.5 g，批號：04150106），瑞德夢減肥茶（規(guī)格：2.5 g，批號：140106），半生緣天信減肥茶（規(guī)格：3 g，批號：141018）。

2方法與結(jié)果

2.1超高效液相色譜分析條件

分析柱：Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm× 2.00 mm，3 μm）；柱溫：35℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：5.0 μL；檢測波長：223 nm。流動相：A為50 mmol/L磷酸氫二鉀以磷酸調(diào)節(jié) pH值為6.0，B為甲醇。按表1進行梯度洗脫。

表1　　梯度洗脫程序

2.2對照品溶液的配制

取酚酞、鹽酸西布曲明、鹽酸N-單去甲基西布曲明、鹽酸N，N-雙去甲基西布曲明對照品各約10 mg，精密稱定，以甲醇制成每1 mL中各含酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明1 mg的溶液作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備溶液1 mL，以甲醇制成各含100 μg/mL的溶液，作為對照品使用液。再以甲醇制成各含50，100，200，300，400，500，1 000 ng/mL的標準系列溶液。

2.3供試品溶液的配制

將8批分別為丸劑、片劑、膠囊劑（取內(nèi)容物）的中藥制劑樣品及12批分別為膠囊（取內(nèi)容物）、片、茶的保健食品樣品研細，各取約0.50 g，精密稱定，置 100 mL量瓶中，加入甲醇約80 mL，超聲處理（功率 250 W，頻率 35 kHz）15 min，放冷至室溫，再加甲醇至刻度定容，搖勻，靜置，取上清液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液，作為待測液。

2.4各成分檢測波長的確定及專屬性試驗

按“2.2”的方法配制對照品溶液，取各含500 ng/mL的對照品溶液試驗。按“2.3”的方法制備供試品（體美減肥膠囊）溶液、空白供試品（靚爾娜輕身減肥片）及空白供試品加標溶液。空白供試品為經(jīng)法定方法［1］中所列的“液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法”確證為陰性的空白供試品。分別取各成分對照品溶液單標、混合對照品溶液、試劑空白溶液、空白供試品溶液、空白供試品加標溶液，按“2.1”項下的條件檢測。結(jié)果見圖1～ 8。

由各成分的紫外吸收光譜圖可知，酚酞的最大吸收波長為229 nm，西布曲明的最大吸收波長為223 nm，N-單去甲基西布曲明的最大吸收波長為223 nm，N，N-雙去甲基西布曲明的最大吸收波長為223 nm。理論上選擇各自的最大吸收波長為檢測波長，可得到最高的檢測靈敏度。比較圖2～ 5的結(jié)果可知，當檢測波長由223 nm變?yōu)?29 nm時，西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明峰的吸收值明顯降低，而酚酞峰的吸收值大致相當，因此當只用一個波長來檢測，為獲得較好的靈敏度，應選擇各成分吸收值均好的223 nm。

由各成分混合對照品溶液、試劑空白溶液、空白供試品溶液、空白供試品加標溶液所采集的色譜圖比較可知，試劑空白及供試品對各成分的檢測無干擾，各成分峰均能基線分離，分離度R均在2.0以上，實測理論塔板數(shù)均在4 000以上。

由于中藥制劑及保健食品成分復雜，經(jīng)液相色譜檢測各成分主峰保留時間與對照品一致且提取的紫外吸收光譜一致，需經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法確證。

圖1　　混合對照223 nm波長采集色譜圖

圖2　　在8.838 min提取的酚酞對照紫外吸收光譜圖

圖3　　在18.004 min提取的西布曲明對照紫外吸收光譜圖

圖4　　在19.773 min提取的N-單去甲基西布曲明對照紫外吸收光譜圖

圖5　　在21.591 min提取的N，N-雙去甲基西布曲明對照紫外吸收光譜圖

圖6　　試劑空白223 nm波長采集色譜圖

圖7　　空白供試品223 nm波長采集色譜圖

圖8　　空白供試品加標223 nm波長采集色譜圖

2.5線性關系及檢出限、定量限考察

采用“2.1”項下的色譜條件，以“2.2”項下的標準系列溶液進樣檢測。以檢測所得峰面積為縱坐標，以標準系列溶液濃度（ng/mL）為橫坐標，進行線性擬合。以采集的色譜圖中檢出峰的信噪比大于3時的濃度（ng/mL）為檢出限，信噪比大于10時的濃度（ng/mL）為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關系數(shù)大于0.99，為線性范圍。結(jié)果如表2。

表2　4種成分標準曲線測定、檢出限和定量限檢測結(jié)果

4種成分在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關系，檢出限均為 30 ng/mL，定量限均為50 ng/mL，靈敏度較高。

2.6精密度試驗

選用標準系列溶液中各成分濃度為500 ng/mL的標準溶液，連續(xù)進樣6針，計算各成分峰面積的相對偏差。結(jié)果如表3。

表3　4種成分精密度檢測結(jié)果

結(jié)果各成分RSD值均在0.16%～ 0.34%之間，精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

選用標準系列溶液中各成分濃度為500 ng/mL的標準溶液，在 0，1，2，4，8，12，24 h分別進樣，以各成分峰面積計算。結(jié)果如表4。

表4　4種成分穩(wěn)定性檢測結(jié)果

結(jié)果各成分RSD值均在0.45%～ 0.76%之間，表明24 h內(nèi)能穩(wěn)定檢測。

2.8回收率試驗

取中藥制劑陰性樣品：丸劑（同仁堂輕身消胖丸）、片劑（靚爾娜輕身減肥片）、膠囊劑（體美減肥膠囊）各1批，取保健食品陰性樣品：茶（碧生源減肥茶）、片（康乃馨殼聚糖左旋肉堿荷葉片）、膠囊（輕身樂減肥膠囊）各1批，按“2.3”項下平行稱樣各3份，分別加入0.05，0.5，5.0 mL每1mL中各含100 μg的對照品使用液，置 100 mL量瓶中，加入甲醇約80 mL，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）15 min，放冷至室溫，再加甲醇至刻度定容，搖勻，靜置，取上清液經(jīng) 0.2 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液測定。3份平行樣最終加標濃度分別為50，500，1 000 ng/mL。以5次平行測定結(jié)果的均值與加標濃度相比較，回收率如表5～ 6。

表5　　中藥制劑中加樣回收試驗結(jié)果

結(jié)果不同類型的中藥制劑及保健食品各成分高、中、低三個濃度的回收率均在95.0%～ 99.8%之間。

2.9樣品測定結(jié)果

檢測了8批次中藥制劑及12批次保健食品，結(jié)果均為陰性，并經(jīng)“液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法”確證為陰性。

表6　　保健食品中加樣回收試驗結(jié)果

3討論

3.1西布曲明及其衍生物非法添加的情況分析

西布曲明的非法添加時有發(fā)生。從最初的直接添加西布曲明發(fā)展為西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明同時添加，這樣能達到有效劑量不變的同時，減低了每一種成分的添加量，增加了檢出難度。且保健食品中非法添加居多。相對藥品，保健食品有服用量較大特點。

以西布曲明日用量5 mg分析。假設添加入某膳食纖維素膠囊，膠囊規(guī)格0.5 g，服用4粒/次，每天3次，日服用量為6 g，則添加質(zhì)量比例為0.083%。如果同時添加2種衍生物，只需0.028%。以取樣量 0.5 g，提取體積 100 mL計，非法添加組分濃度為1.4 μg/mL。

按法定方法［1］檢測。分析柱：DIKMA C18（250 mm ×4.5 mm，5 μm）；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；流動相：A為20 mmol/L乙酸銨用乙酸調(diào)節(jié) pH值為 4.0，B為乙腈，A∶B 為56∶44；檢測波長：225 nm。采集的混合對照品（各10 μg/mL）色譜圖如圖9所示。其中西布曲明峰的保留時間為7.605 min，酚酞峰與N-單去甲基西布曲明峰混在一起合成一個峰前半部分為酚酞，后半部分為N-單去甲基西布曲明，其保留時間為8.553 min，N，N-雙去甲基西布曲明峰保留時間為11.481 min。可見：檢測組分難以分離，且色譜圖基線噪聲較大。當對照品濃度為0.5 μg/mL時，則無法檢出，如圖 10，可能造成假陰性結(jié)果。且按法定之方法［1］，只有經(jīng)液相色譜法檢測為陽性的才需用液質(zhì)法確證。液相色譜能否檢出，直接關系到是否檢出。因此，從改善分離度，提高檢出限的目的出發(fā)，有必要重新建立色譜條件。

圖9　　混合對照（各10 μg/mL）225 nm波長采集色譜圖

3.2流動相的選擇

流動相中改性劑的選擇：原檢驗標準中采用的是pH值為4.0乙酸銨-乙酸緩沖液，而乙酸鹽的UV截止波長為230～ 240 nm，在此波長以下檢測，噪聲會急劇增大，嚴重影響檢出限；而磷酸鹽在低于200 nm時基本無吸收，所以本法采用磷酸氫二鉀-磷酸緩沖液。又因磷酸鹽緩沖液與乙腈混合，很有可能產(chǎn)生鹽析，危害色譜系統(tǒng)，故采用本法的“磷酸氫二鉀-磷酸緩沖液-甲醇”流動相系統(tǒng)。事實也證明，“磷酸氫二鉀-磷酸緩沖液-甲醇”流動相系統(tǒng)色譜圖基線平穩(wěn)，噪聲小，有利于提高靈敏度得到較高的檢出限（圖1～ 8）。

3.3洗脫條件的選擇

先試用等度洗脫的方式。以流動相：A為50 mmol/L磷酸氫二鉀以磷酸調(diào)節(jié)pH值為 6.0，B為甲醇，A∶B為 25∶75等度洗脫，檢測波長：225 nm。結(jié)果見圖11～ 15，西布曲明對照與N-單去甲基西布曲明對照峰不能完全分離，且西布曲明對照、N-單去甲基西布曲明對照與N，N-雙去甲基西布曲明對照峰柱效較低（n=2 000）。因此需采用梯度洗脫的方法，采用本法中的梯度洗脫方式，225 nm檢測，采集的色譜圖如圖25所示，各成分的分離度、柱效（n＞ 10 000）均達到滿意的效果。

圖10　　混合對照（各0.5 μg/mL）225 nm波長采集色譜圖

圖11　　酚酞對照225 nm波長采集色譜圖

圖12　　西布曲明對照225 nm波長采集色譜圖

圖13　N-單去甲基西布曲明對照225 nm波長采集色譜圖

圖14　N，N-雙去甲基西布曲明對照225 nm波長采集色譜圖

圖15　　混合對照225 nm波長采集色譜圖

圖16　　混合對照225 nm波長采集色譜圖（梯度洗脫）

3.4檢測波長及流動相pH的選擇

試驗表明，以各成分的紫外吸收光譜中的最大吸收波長檢測，能得到最高的靈敏度。因此可選用檢測波長：酚酞229 nm，西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明223 nm。但酚酞在檢測波長223 nm與 229 nm下靈敏變化不大，為了簡便可選用223 nm。

酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明在酸性條件下易溶，因此流動相偏酸性。流動相酸性偏強，對西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明峰的洗脫明顯增強，會使三個峰擠在一起，不易分離，為使分離度合適，流動相酸性不能太強。經(jīng)試驗比較了磷酸鹽緩沖液pH值分別為4.0，5.0及6.0，結(jié)果采用本法以流動相A為50 mmol/L磷酸氫二鉀以磷酸調(diào)節(jié)pH值為6.0，分離較好。

3.5梯度洗脫引起的基線漂移對檢測靈敏度的影響

在用梯度洗脫進行高靈敏度的試驗時，由于流動相組成的不斷改變，引起流動相吸收值的不斷改變，而產(chǎn)生基線漂移，這將大大增加檢測的噪聲，影響靈敏度。但綜合圖11～ 16的結(jié)果來比較，采用等度洗脫，西布曲明對照、N-單去甲基西布曲明對照與N，N-雙去甲基西布曲明對照峰的理論塔板數(shù)在2 000左右，且不能完全分離；采用本法梯度洗脫后，西布曲明對照、N-單去甲基西布曲明對照與N，N-雙去甲基西布曲明對照峰的理論塔板數(shù)分別為11 524，13 048，14 336，且基線完全分離。經(jīng)試驗，各成分檢出限濃度為30 ng/mL，定量限濃度為50 ng/mL，接近液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢測水平。

綜上所述，本法為一種靈敏度較高的檢測減肥類中藥制劑及保健食品中非法添加酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明等4種成分的超高效液相色譜-二極管陣列聯(lián)用的檢測方法。

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Determination of Four Components Illegally Mixed into Traditional Chinese Medicine for Antiobesity and into Healthy Foods by UPLC-DAD

Tu Fenglian1，Wang Yuanfu2
（1 Traditional Chinese Medicine Hospital of Nanchang City Xinjian District，Jiangxi Nanchang 330100，China；2 Nanchang Institute for Food and Drug Control，330038）

Objective：To establish a UPLC-DAD method for determination of four components（phenolphthalein，sibutratmine，N-monodesmethylsibutramine，N，N-didesmethylsibutramine）illegally mixed into Traditional Chinese Medicines antiobesity and into healthy foods.Methods：The analysis was performed with a Phenomenex Luna C18（2）100A column（150 mm×2.00 mm，3 μm）using phosphate buffer（50 mmol/L dipotassium hydrogen phosphate，adjusted to pH 6.0 with phosphoric acid-methanol as mobile phase by gradient elution.The column temperature was 35℃，while the flow rate was 0.2 mL/min，and the injection volume was 5.0 μL.Diode array detector was used.Results：The detection limit of this method was 30 ng/mL，while the quantitation limit was 50 ng/mL，and the linear range was 50～ 1 000 ng/mL.The correlation coefficient of test results within the linear range was more than 0.99，and the average recovery rates were 96.0% ～ 101.2%.Conclusion：The developed method was simple，rapid，accurate，highly sensitive and highly specific，by which the results of rapid deter-mination of illegal additives in traditional Chinese medicines for antiobesity and healthy foods were superior to those by HPLC method in the current legal standard.

UPLC-DAD；Traditional Chinese Medicines for Antiobesity and Healthy Foods；Phenolphthalein；Sibutratmine；N-Monodesmethylsibutramine；N，N-Didesmethylsibutramine；Illegal Additive

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.04.005

涂鳳蓮，女，主管藥師。研究方向：臨床藥學、醫(yī)院藥學。E-mail：wanngels@sina.com汪元符，男，主管藥師。研究方向：中藥理論、藥物檢測及食品安全。通訊作者E-mail：wanngel@126.com

2016-01-11）