環孢素軟膠囊溶出度H PLC檢測方法改進研究

劉虹　　趙海鵬　　李源　　陳燕

（濰坊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濰坊 261205）

環孢素軟膠囊溶出度H PLC檢測方法改進研究

劉虹趙海鵬李源陳燕

（濰坊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濰坊 261205）

目的：對環孢素軟膠囊溶出度檢測高效液相色譜（HPLC）方法進行改進。方法：采用漿法，含0.1 mol/L HCl的0.5%十二烷基磺酸鈉為溶出介質，轉速75 rpm，分別于第15，30，45，60，75，90 min取樣，測定4個廠家產品的溶出度，繪制溶出曲線。HPLC色譜條件為：C8（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；0.1%三氟乙酸∶四氫呋喃∶乙腈∶0.5%三乙胺（磷酸調pH為2.4）（20∶25∶40∶15）為流動相，柱溫60℃，流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm。結果：本方法線性范圍為5～ 100 μg/mL，定量限、檢測限分別為2.6，0.86 μg/mL。4個廠家的樣品在90 min內溶出度均超過標示量的80%，但溶出曲線存在明顯差別。結論：本方法準確、可靠，靈敏度高，能夠區分不同廠家產品的溶出特征，適用于環孢素軟膠囊溶出度的檢測。

環孢素軟膠囊；溶出度；高效液相色譜法

環孢素是一種環肽類免疫抑制劑，主要用于預防組織器官移植的排斥反應及自身免疫性疾病。根據國家食品藥品監督管理總局網站查詢結果，目前國內批準上市的環孢素制劑已達14家，劑型主要為軟膠囊制劑。環孢素存在環孢素H、異環孢素A等多種雜質，且環孢素在高效液相色譜（HPLC）系統中存在構象異構體變換。其軟膠囊則含有表面活性劑及中長鏈油脂等親油性內容物。上述雜質、構象異構體及內容物的存在對其溶出度的測定均存在干擾，影響檢測結果的準確性。

《中國藥典》未收錄環孢素軟膠囊質量標準，部頒標準WS1-（-144）2004Z［1］未對其溶出度檢測作出規定。目前國內尚缺乏關于環孢素軟膠囊溶出度檢測方法的文獻報道，本文參考國內外質量標準［2］及文獻方法［3-4］對環孢素軟膠囊溶出度測定的HPLC檢測方法進行了研究，建立的HPLC方法專屬性強、靈敏度高、準確度和重復性好、方法簡便，有利于環孢素軟膠囊的質量控制和監管。

1儀器和試藥

1.1儀器

美國Agilent1200型高效液相色譜儀（G1310A泵，G1316A柱溫箱，G1329A自動進樣器，G1314 BVWD紫外檢測器），XS-205型電子分析天平（Mettler-Toledo公司），ZRS-6G藥物溶出實驗儀（天津市天大天發科技有限公司），PHS-3C型精密pH計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2試藥

環孢素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130495-200202）；環孢素軟膠囊（規格：25 mg）由N、H、C、S 4家公司提供（批號：S057，140502HB，110902201，11171023）。三氟乙酸、四氫呋喃、乙腈、三乙胺為色譜純，水為超純水。其余試劑為分析純。

2色譜條件與方法

2.1色譜條件與系統適用性

色譜柱：Phenomenex LunaC8（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%三氟乙酸∶四氫呋喃∶乙腈∶0.5%三乙胺（磷酸調pH為2.4）（20∶25∶40∶15）；柱溫：60℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL。理論塔板數按環孢素峰計算不低于2 000，環孢素峰與相鄰峰的分離度不低于1.7，重復進樣的相對標準偏差不大于2.0%［3］。

2.2溶液制備

2.2.1供試品溶液制備取本品，照溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2015年版四部通則 0931第二法），以含 0.1 mol/L HCl的0.5%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）水溶液1 000 mL為溶出介質，轉速為75 rpm，依法操作，經45 min取溶液適量，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.2對照品溶液制備精密稱取環孢素對照品，加“2.2.1”項下溶出介質溶解，分別稀釋制成2，5，15，30，60，100，140 μg/mL濃度的溶液。

2.2.3空白輔料溶液制備各廠家輔料存在差異，因此以4個廠家的常見輔料：明膠、無水乙醇、玉米油、1，2-丙二醇、甘油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、單硬脂酸甘油酯、山梨醇等為輔料，依處方量按“2.1.1”項供試品溶液制備方法配制空白輔料溶液。

2.3樣品測定

精密量取供試品溶液及對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算出對應時間點每粒膠囊的溶出度，繪制溶出曲線。

3方法學考察

3.1檢測條件考察

3.1.1色譜柱的選擇《中國藥典》2015年版［5］、《美國藥典》［2］HPLC測定環孢素軟膠囊含量的色譜柱為C18柱，柱溫需要達到70～ 80℃。試驗中發現，按照《美國藥典》［2］色譜條件測定環孢素軟膠囊溶出度時，主峰與共洗脫峰無法有效分離；采用C8柱可將主峰與共洗脫峰有效分離。結果見圖1。3.1.2柱溫的選擇試驗中對不同溫度下（55，60，65，70℃）環孢素軟膠囊的峰形進行了考察，結果見圖2。環孢素主峰峰形隨溫度升高趨于尖銳。65，70℃下，主峰與共洗脫峰未能有效分離；55℃下主峰與共洗脫峰分離效果較好，但理論塔板數低于700，分離效率較低。因此本實驗選用60℃柱溫進行溶出度測定。

3.1.3流動相的選擇國內外藥品標準［1，2，5］及文獻［3-4］用于環孢素含量測定的流動相包括乙腈-水-叔丁基甲醚-磷酸（430∶520∶50∶1）、四氫呋喃-水（80∶20）等。試驗中發現采用上述流動相普遍存在環孢素峰出峰晚（12～ 15 min）及峰形拖尾問題。因此本文對流動相組成進行調整，加入三乙胺作為掃尾劑，并對流動相配比進行了考察，結果表明，采用“2.1”項下流動相可使環孢素主峰出峰時間縮短至7.2 min（見圖1～ 2），平均峰寬為0.55，環孢素主峰與相鄰峰的分離度為（1.7± 0.2）；平均拖尾因子為1.04。

圖1　溶出介質中環孢素軟膠囊的HPLC色譜圖

圖2　不同溫度下溶出介質中環孢素軟膠囊的HPLC色譜圖

3.1.4溶出介質的選擇《美國藥典》［2］中環孢素膠囊劑溶出度測定所用介質為水或含 0.1 mol/L HCl的0.5%SDS水溶液。試驗中比較了環孢素軟膠囊在超純水和含0.1 mol/L HCl的0.5%SDS水溶液兩種介質中的色譜分離行為。結果見圖3。在超純水中，環孢素主峰與共洗脫峰未能有效分離；在含0.1 mol/L HCl的0.5%SDS水溶液中，環孢素主峰與共洗脫峰可有效分離，因此選用含0.1 mol/L HCl的0.5%SDS水溶液作為溶出介質。

圖3　環孢素及軟膠囊在不同溶出介質中的色譜圖

3.1.5溶出方法及轉速的選擇《美國藥典》［2］中環孢素軟膠囊溶出度測定采用漿法，轉速為50 rpm。試驗中考察了藍法（50，75 rpm）和漿法（50，75 rpm）的溶出曲線，結果見圖4。4種條件下，環孢素軟膠囊在45 min內均可達到溶出平臺。其中漿法75 rpm溶出曲線更為理想且能夠區分不同廠家產品的溶出曲線。

3.2方法學考察

3.2.1專屬性試驗分別依次取對照品溶液、供試品溶液和空白輔料溶液按“2.1”項下色譜條件進樣分析，色譜圖見圖5，可見空白輔料不干擾環孢素的測定。

圖4　不同溶出方法和轉速下環孢素軟膠囊的溶出曲線

圖5　　對照品（A）、供試品（B）及空白輔料（C）HPLC色譜圖

3.2.2線性范圍及標準曲線取“2.2.2”項下不同濃度的對照品溶液，注入液相色譜，以環孢素濃度（μg/mL）對峰面積進行線性回歸（圖6）。線性方程為：

Y=35.75X+185（R2=0.999 9），

線性范圍為5～ 100 μg/mL。

圖6　　環孢素含量測定標準曲線

3.2.3精密度試驗日內精密度：取對照品適量，按“2.2.2”項下方法配成 20，40，80 μg/mL的溶液，每隔2 h測定一次，連續測定5次，記錄峰面積并計算5次峰面積的 RSD；日間精密度：取上述溶液，每日同一時間測定1次，連續測定3天，記錄峰面積并計算3次峰面積的RSD。結果見表1。

表1　　環孢素在流動相中的日內及日間精密度

3.2.4穩定性試驗取“2.2.1”項下供試品溶液1份，依法分別于0，3，6，9，12，24 h進樣分析，結果環孢素峰面積的RSD為0.26% （n=6），表明環孢素溶液在24 h內穩定。

3.2.5回收率試驗按處方量的 80%，100%，120%精密稱取環孢素對照品20，25，30 mg各 3份，加入處方量輔料，溶出介質溶解，容量瓶中定容至500 mL，搖勻、靜置。精密吸取上清液 1 mL 于 10 mL容量瓶中，溶出介質稀釋至刻度，過濾，取續濾液 10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，計算回收率及 RSD。結果見表2。

3.2.6定量限和檢測限取“2.2.1”項下對照品，配成系列濃度的溶液，取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀，依法測定。信噪比S/N=10時，環孢素濃度為2.6 μg/mL，當信噪比S/N=3時，環孢素濃度為0.86 μg/mL。因此該法的定量限和檢測限分別為2.6 μg/mL和0.86 μg/mL。

4結果與結論

取4個廠家的環孢素軟膠囊樣品，照溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2015年版四部通則0931第二法），以“2.2.1”項下溶出介質1 000 mL為介質，轉速為75 rpm，依法操作，分別于第15，30，45，60，75，90 min取溶液適量，濾過，取續濾液作為供試品溶液。另精密稱取環孢素對照品適量，加溶出介質溶解并稀釋制成與供試品溶液相同濃度的溶液，作為對照品溶液。分別精密量取上述兩種溶液各 10 μL，照“2.1”項下色譜條件測定，并按外標法以峰面積計算每粒的溶出量。限度為90 min內溶出度不低于標示量的80%［2］。

表2　　環孢素回收率試驗結果

依法測定，同批次樣品均測定6次（n=6），計算各時間點的溶出度（%），結果見圖7。

圖7　　不同樣品的溶出曲線

由圖可見，4種樣品在90 min內的溶出度均超過標示量的80%，符合《美國藥典》［2］標準要求，但4種樣品溶出速度存在顯著差異，樣品達到標示量80%的速度依次為N＞H＞S＞C。通過溶出曲線可見，4種樣品溶出度達到最值后其曲線均存在輕微下行趨勢，可能是由于環孢素降解所致。

5討論

環孢素治療指數較窄［6］，治療劑量與毒性劑量接近。其體外溶出行為的差異對藥物體內吸收、藥效及毒性造成的影響相比其他藥物更為顯著。由于我國尚缺乏環孢素制劑的溶出度測定法定標準，本文參考國外藥典標準［2］及文獻對環孢素軟膠囊的溶出度測定方法進行了改進研究，并對不同廠家環孢素軟膠囊的溶出曲線進行了比較研究。

《美國藥典》［2］中環孢素膠囊含量測定常用 C18柱，柱溫普遍高于70℃，導致色譜柱壽命縮短，僅能維持2～ 4周［7］。本文比較了C18與C8兩種色譜柱對環孢素軟膠囊主藥及輔料的分離效果。結果表明，C8在較低溫度下仍能夠實現主藥及輔料的有效分離，且在本色譜條件下主藥出峰時間較快，有利于延長色譜柱壽命，縮短分析時間。《美國藥典》環孢素膠囊溶出度測定轉速為 50 rpm，指標為90 min內藥物溶出度，本次實驗研究表明，所測樣品在45 min內溶出度均可超過標示量的80%，因此上述標準存在偏低的問題。

仿制藥質量一致性評價是目前我國藥品監管的主要工作之一。我國已發布《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》，旨在通過體外溶出度試驗確認藥品質量和療效的一致性。本研究采用建立的HPLC方法對不同廠家產品的溶出度進行了測定，雖然所測樣品的溶出度均符合要求，但其溶出曲線存在明顯差異，原研廠家產品（N）的溶出速度快于國產品種（C、H、S），而國產品種之間的溶出速度也存在明顯差別。上述溶出速度的差異可能是導致臨床療效差異的原因之一。

由于不同廠家環孢素軟膠囊輔料配方及配比可能存在不同，進而導致溶出度產生差異。而本研究的HPLC方法中，空白輔料溶液的選取可能無法反映不同廠家產品輔料的差異，因此，本HPLC方法的專屬性試驗可能存在一定的局限。

綜上，本實驗建立的環孢素軟膠囊溶出度HPLC檢測方法能夠有效解決環孢素主峰展寬及輔料干擾問題，主峰出峰時間快，方法準確、精密、具有較寬的線性范圍，相比現有方法，能夠在較低溫度下實現環孢素軟膠囊溶出度測定，且能夠區分不同廠家產品的溶出曲線，適用于環孢素軟膠囊溶出度檢查和評價。

［1］ 國家藥典委員會.新藥轉正標準（55冊）［M］.北京：人民衛生出版社，2008：53.

［2］ 美國藥典委員會.美國藥典［S］.VSP35-NF30.北京：化學工業出版社，2011：2794-2795.

［3］ 劉浩，仇士林.HPLC法測定環孢素膠囊中環孢素及降解產物的含量［J］.中國抗生素雜志，2002，27（4）：227-231.

［4］龐文哲，宋更申，王茉莉.HPLC法同時測定環孢素注射液的含量和有關物質［J］.中國藥房，2015，26（3）：399-401.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：583-584.

［6］ 孟金薇，司繼剛，袁姜.高效液相色譜法測定環孢素A血藥濃度的方法改進［J］.中國藥業，2003，12（9）：38.

Improvement of HPLC Method for Determination of Dissolution of Ciclospor in Soft Capsules

Liu Hong，Zhao Haipeng，Li Yuan，Chen Yan
（Weifang Institute for Food and Drug Control，Shandong Weifang 261205，China）

Objective：To improve the HPLC method for determination of dissolution of ciclosporin soft capsules.Methods：The paddle method was adopted using 0.5%sodium dodecyl sulfonate containing 0.1 mol/L HCl as a media at a rotation rate of 75 rpm.Samples were taken from the products of manufacturers at time points（15，30，45，60，75 and 90 min）and determined for dissolution，based on which a dissolution curve was plotted.HPLC was performed with C8（2）column（4.6 mm×250 mm，5 μm）at a column temperature of 60℃，using the mixture of 0.1%trifluoroacetic acid，tetrahydrofuran，acetonitrile and 0.5%triethylamine（20∶25∶40∶15，adjusted to pH 2.4 using phosphoric acid）as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The wavelength for detection was 210 nm.Results：The linear range of the method was 5～ 100 μg/mL，while the quantitation and detection limits were 2.6 and 0.86 μg/mL，respectively.All the dissolutions of samples from four manufacturers within 90 min were more than 80%of the stated amount.However，the dissolution curves of the samples showed significant difference.Conclusion：The HPLC method was accurate，reliable and highly sensitive，which distinguished the dissolution characters of products from various manufacturers，and was suitable for the determination of dissolution of ciclosporin soft capsules.

Ciclosporin Soft Capsules；Dissolution；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.04.003

劉虹，女，主管藥師。研究方向：藥品檢驗。通訊作者E-mail：liuhong1969@163.com

2016-01-07）