篤斯越橘花青苷途徑中CHS基因的克隆與序列分析

楊　洋，　崔百會(huì)，　劉　喆，　曹后男，　宗成文

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

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篤斯越橘花青苷途徑中CHS基因的克隆與序列分析

楊洋，崔百會(huì)，劉喆，曹后男，宗成文*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

摘要：以篤斯越橘花朵為試材，根據(jù)兔眼藍(lán)莓查爾酮合成酶(VaCHS)mRNA全長序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增出長度大約為1 400 bp目的片段，經(jīng)測(cè)序,結(jié)果表明，篤斯越橘CHS基因(VuCHS)cDNA序列全長1 391 bp，包含1 170 bp開放閱讀框(ORF)，編碼389個(gè)氨基酸，將篤斯越橘CHS基因(VuCHS)編碼的蛋白質(zhì)與其他來源的查爾酮合成酶蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與兔眼藍(lán)莓、杜鵑花和獼猴桃的一致性分別為99%、93%和93%，該基因蛋白質(zhì)的氨基酸序列與其他植物CHS基因蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)化分析表明，與兔眼藍(lán)莓和獼猴桃屬于同一分支，與兔眼藍(lán)莓親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞：篤斯越橘；CHS基因；克隆；序列分析

篤斯越橘(Vacciniumuliginosum)，為杜鵑花科越橘屬植物，落葉灌木[1]，其果皮含有豐富的花青素，具有抗氧化性[2]，對(duì)眼科和心血管疾病具有很好的療效[3-4]。花青素又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物，多以糖苷的形式存在，也稱花色苷，是植物花和果實(shí)呈現(xiàn)艷麗顏色的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。花青素存在于許多新鮮果實(shí)中，是一種促進(jìn)健康的重要植物化學(xué)物質(zhì)[6]，是由苯丙氨酸先轉(zhuǎn)化為4-香豆酰CoA，然后在CHS(查爾酮合成酶)、CHI(查爾酮異構(gòu)酶)、FHT(黃烷酮-3β-羥基化酶)、F3’H(類黃酮3′-羥化酶)、F3’5’H(類黃酮3′5′-羥化酶)、DFR(黃烷酮醇4-還原酶)、ANS(花青素合成酶)等多種酶的作用下形成，再在MYB、WD40、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子的作用下使得花青素在UFGT(UDP葡萄糖-類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控下與糖結(jié)合形成相對(duì)穩(wěn)定的花青苷[7]，再進(jìn)一步形成自然界中所看到的各種顏色。

查爾酮合成酶(CHS)是花色苷合成途徑中，第1個(gè)關(guān)鍵的酶基因，有報(bào)道指出[8-9]，分別導(dǎo)入正義CHS基因和反義CHS基因在開粉紅色的菊花中，結(jié)果獲得了開淺紅色和白色花的轉(zhuǎn)基因植株，相同的技術(shù)在牽牛、天竺葵和玫瑰中也取得了成功[10-12]。楊會(huì)娜等[13]人研究表明，在棕色棉中，CHS基因的表達(dá)量明顯高于白色棉。Li等[14]和宋楊等[15]人研究中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓和越橘花青苷合成過程中CHS基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與果實(shí)中花青苷含量的變化相一致。說明CHS基因在植物花色、果實(shí)著色等方面起著非常重要的作用。

在越橘屬的其它種中，如歐洲越橘[16]、高叢越橘[7]和藍(lán)莓[14]等，有關(guān)花青苷合成相關(guān)的研究均有報(bào)道，但有關(guān)篤斯越橘花青苷途徑中全長基因克隆的研究卻未見報(bào)道。所以本研究以篤斯越橘盛花期花朵為試材，克隆其CHS基因，并進(jìn)行序列分析，為以后探索篤斯越橘果皮著色機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

取自延邊大學(xué)溫室大棚中栽植的篤斯越橘盛花期花朵。

1.2試劑

植物RNA快速提取試劑盒、凝膠回收試劑盒(購自北京華越洋公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體試劑盒、普通Taq酶、ExTaq酶、dNTPs、Mix Buffer和大腸桿菌DH5a等[均購自Takara(大連)工程有限公司]，引物由invitrogen(上海)公司合成。

1.3RNA的提取與cDNA全長的克隆

根據(jù)植物RNA快速提取試劑盒的說明，提取篤斯越橘花朵的總RNA；將提取的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1條鏈，利用在GeneBank中登錄的兔眼藍(lán)莓CHS基因(VaCHS)的mRNA序列全長(登錄號(hào)：AB694903)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成篤斯越橘CHS基因(VaCHS)的特異引物:

VaCHSF：

5’-CACACATTCTCACTTAACCCTCC -3’

VaCHSR：

5’-ACAATAGGCTTTATCAGCCCTT -3’

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)后，根據(jù)膠回收試劑盒的說明切膠回收目的條帶，最后根據(jù)pMD18-T載體試劑盒的說明將目的基因與載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑選陽性克隆，并進(jìn)行PCR菌液檢測(cè)，篩選與目的條帶大小相一致的菌液送invitrogen(上海)公司測(cè)序，獲得其cDNA的全長。

1.4序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用 ClustalX 1.81[17]及其默認(rèn)參數(shù)生成多重序列比對(duì)，GeneDoc 生成比對(duì)結(jié)果。用MEGA5.1(Phylogenetic and molecular evolutionary analyses version 5.1)[18]構(gòu)建鄰接樹(neighbour joining tree，NJ tree)，均用1 000個(gè)重復(fù)進(jìn)行Bootstrap檢驗(yàn)，采用默認(rèn)的 Poisson correction 模型和 complete deletion 選項(xiàng)。

2結(jié)果與分析

2.1RNA提取與RT-PCR擴(kuò)增

提取的篤斯越橘總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1A)，結(jié)果表明，提取的RNA無其它雜質(zhì)殘留，質(zhì)量可用于后續(xù)試驗(yàn)。以其花朵的cDNA為模板進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增(圖1B)，獲得了大約1 400 bp的片段，與預(yù)計(jì)的片段大小相一致。

M:DL2000Marker；A：提取的總RNA；B：VuCHS基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2序列分析

測(cè)序結(jié)果表明，克隆得到的VaCHS基因的cDNA全長為1 391 bp，包含1 170 bp開放閱讀框(ORF)，編碼389個(gè)氨基酸(圖2)，利用DNAMAN分析軟件對(duì)預(yù)測(cè)的VaCHS蛋白質(zhì)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其分子質(zhì)量為42 527.24 Da，等電點(diǎn)pI為5.91。

圖2　VuCHS基因堿基序列及所編碼的氨基酸序列

經(jīng)BLAST蛋白質(zhì)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)篤斯越橘CHS基因(VuCHS)，與GeneBank中報(bào)道的兔眼藍(lán)莓和杜鵑花CHS基因蛋白質(zhì)序列的同源性分別達(dá)到99%和93%，與其它科屬如獼猴桃、元寶草、陸地棉、山茶花等一致性分別為93%、93%、92%和93%，說明所克隆的VuCHS基因是查爾酮合成酶基因,并用GeneDoc軟件將篤斯越橘CHS基因(VuCHS)編碼的蛋白質(zhì)與已知其他來源的查爾酮合成酶蛋白的氨基酸序列用ClustalX 1.81軟件進(jìn)行對(duì)比(圖3)，在氨基酸的第32處，篤斯越橘的氨基酸翻譯為天冬氨酸(D,Asp)，與其他植物相同，而兔眼藍(lán)莓在該處翻譯的氨基酸是谷氨酸(E,Glu)，在氨基酸的第351處，篤斯越橘氨基酸翻譯為蛋氨酸(M,Met)，而其他植物該處氨基酸翻譯為賴氨酸(K,Lys)。

“▲”為與其他植物不同的氨基酸

利用MEGA5.1軟件生成系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，由圖可知，篤斯越橘與兔眼藍(lán)莓和獼猴桃、重瓣映山紅、山茶、野茶樹屬于同一個(gè)分支，與兔眼藍(lán)莓的親緣關(guān)系最近[19]。

GhCHS陸地棉(ABS52573);AeCHS秋葵(AGW22222);GrCHS1雷蒙德氏棉(XP_012481763);GaCHS1木本棉(KHG25969);NnCHS荷花(ADD74168);EgCHS1巨桉(XP_010023738);MmCHS多花野牡丹(AGW24283);HsCHS元寶草(AFU52909);HpCHS金絲桃(AAL67805);VuCHS篤斯越橘;VaCHS兔眼藍(lán)莓(BAO58434);AcCHS獼猴桃(AGV53049);RsCHS杜鵑花(CAC88858);CjCHS山茶花(BAI66465);CsCHS野茶樹(AAO13091);VvCHS葡萄(BAB84111);JcCHS1麻風(fēng)樹(NP_001295723);PpeCHS碧桃(AEJ88217);PaCHS甜櫻桃(AJO67963);PceCHS櫻桃李(AKV89241);FaCHS草莓(BAE17124);RrCHS玫瑰(AKT71852);PbCHS-like白梨(XP_009370115);MtCHS變?nèi)~海棠(ADV29810);SaCHS歐洲花楸(ABB89213);MdCHS蘋果(BAB92996);PpyCHS沙梨(AFQ92052);PcoCHS西洋梨(AAX16494)。

3討論與結(jié)論

本研究所克隆的篤斯越橘CHS基因cDNA全長為1 391 bp，包含1 170 bp開放閱讀框(ORF)，編碼由389個(gè)氨基酸組成的蛋白，經(jīng)BLAST蛋白質(zhì)比對(duì)與其他植物的一致性高達(dá)89%～99%,可以初步斷定所克隆的VuCHS是CHS基因。查爾酮合成酶的主要功能是催化1分子的香豆酰CoA與3分子的丙二酰CoA縮合反應(yīng)形成查爾酮[20]，是類黃酮途徑中第1個(gè)關(guān)鍵酶，經(jīng)NCBI中ProteinsBLAST比對(duì)分析得知[21]，其保守區(qū)極具保守性；本研究所克隆的VuCHS基因是屬于CHS超基因家族，具有該蛋白活性位點(diǎn)、產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)和丙二酰CoA結(jié)合位點(diǎn)(圖5)，進(jìn)一步證實(shí)了本試驗(yàn)所克隆的VuCHS基因?yàn)镃HS基因。

圖5　篤斯越橘CHS基因編碼蛋白功能構(gòu)域分析

前人的研究表明，CHS基因不僅與植物的花色有關(guān)[10-12]，還與植物的育性有關(guān)。邵莉等人[22]，將CHS-A基因?qū)氲桨珷颗Ｖ校粌H改變了花的顏色還出現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象，其實(shí)早在玉米中就有這類現(xiàn)象，CHS基因的突變導(dǎo)致出現(xiàn)了白色不育的花粉粒[12,22]。CHS基因是花青苷途徑中一個(gè)重要的酶基因，與果實(shí)的色澤也有重要的聯(lián)系，所以對(duì)篤斯越橘CHS基因的克隆，為以后該植物花色、育性、果皮色澤等研究提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志(57卷)[M].北京：科學(xué)出版社,1991：156-158.

[2]盧艷花，鄒彥平，秦會(huì)玲，等. 歐洲越桔和篤斯越橘體外抗氧化活性比較[J].中草藥,2004(06):9-80.

[3]宗長玲，鄧萌，宗成文，等.篤斯越橘研究進(jìn)展[J].北方園藝,2011(12):173-176.

[4]金彥磊，王秀華，楊永富，等.越橘離體培養(yǎng)的組織學(xué)研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2009,21(01):25-29.

[5]李金星，胡志和.藍(lán)莓花青素的研究進(jìn)展[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2013(06):817-822.

[6]Jaakola L,Poole M,Jones M O,et al.A SQUAMOSA MADS box gene involved in the regulation of anthocyanin accumulation in bilberry fruits[J].Plant Physiol，2010,153(04):1619-1629.

[7]Zifkin M,Jin A,Ozga J A,et al.Gene Expression and Metabolite Profiling of Developing Highbush Blueberry Fruit Indicates Transcriptional Regulation of Flavonoid Metabolism and Activation of Abscisic Acid Metabolism[J].Plant Physiology,2012,158(01):200-224.

[8]Courtney-Gutterson N,Napoli C,Lemieux C,et al.Flower color modifications of Torenia hybrida by cosuppression of anthocyanin biosynthesis genes[J].Molecular Breeding,2000,6(03):239-246.

[9]胡朝陽，周友鳳，龔一富，等.紫色馬鈴薯查爾酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(05):832-839.

[10]Campos E G,Hamdan F F.Cloning of the chaperonin t-complex polypeptide 1 gene from Schistosoma mansoni and studies of its expression levels under heat shock and oxidative stress[J].Parasitol Res,2000,86(03):253-258.

[11]趙云鵬，陳發(fā)棣，郭維明.觀賞植物花色基因工程研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào),2003(01):51-58.

[12]王燕，許鋒，程水源.植物查爾酮合成酶分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(08):5-9.

[13]楊會(huì)娜，田新惠，李艷軍，等.天然棕色棉查爾酮合成酶基因(GhCHS1)的克隆和實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析[J].棉花學(xué)報(bào),2010(01):42-48.

[14]Li X,Sun H,Pei J,et al.De novo sequencing and comparative analysis of the blueberry transcriptome to discover putative genes related to antioxidants[J].Gene,2012,511(01):54-61.

[15]宋楊，劉紅弟，張紅軍，等.“澤西”越橘花青苷積累與相關(guān)基因表達(dá)研究[J].中國南方果樹,2015,44(06):13-20.

[16]Jaakola L,Maatta K,Pirttila A M,et al.Expression of genes involved in anthocyanin biosynthesis in relation to anthocyanin, proanthocyanidin,and flavonol levels during bilberry fruit development[J].Plant Physiol，2002,130(02):729-739.

[17]Thompson J D,Gibson T J,Plewniak F,et al.The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res，1997,25(24):4876-4882.

[18]杜玉杰.構(gòu)建分子系統(tǒng)樹的簡易方法[J].生物學(xué)通報(bào),2013(04):4-6.

[19]楊琦玥，陳通，李鍵，等.豬NLRC5基因克隆及序列特征分析[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,42(01):39-46.

[20]許鋒，程水源.植物查爾酮合成酶分子生物學(xué)研究進(jìn)展及展望[C].中國園藝學(xué)會(huì)第七屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集,2006(07):821-827.

[21]高穎，李夢(mèng)竹，馮紫洲，等.蓖麻PAL基因片段的克隆與序列分析[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,28(02),179-182.

[22]邵莉，李毅，楊美珠，等.查爾酮合成酶基因?qū)D(zhuǎn)基因植物花色和育性的影響[J].植物學(xué)報(bào),1996,38(07):517-524.

收稿日期：2016-04-13基金資助:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460504)；吉林省科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(20120251)

作者簡介：楊洋(1991—)，女，吉林敦化人，在讀碩士，研究方向?yàn)楣麡渖锛夹g(shù)。宗成文為通信作者， E-mail:zongchengwen@aliyun.com

文章編號(hào)：1004-7999(2016)02-0093-06

DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2016.02.001

中圖分類號(hào)：S663.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning and sequence analysis of Chalcone Synthase gene in anthocyanin biosynthesis pathway of Vaccinium uliginosum

YANG Yang，CUI Baihui，LIU Zhe，CAO Hounan，ZONG Chengwen*

(AgriculturecollageofYanBianUniversity,YanjiJilin133002，China)

Abstract：Using one pair of specific primers designed based on the mRNA full-length sequence of Chalcone synthase in Vaccinium ashei accessioning on GeneBank, a target DNA fragment about 1 400 bp long was amplified from the total RNA of Vaccinium uliginosum by RT-PCR. Sequencing result showed that full length of the cDNA sequence of Chalcone synthase gene from Vaccinium uliginosum was 1 391 bp with 1 170 bp open reading frame encoding a protein comprise of 389 amino acids. The identities of amino acid sequences of the protein encoded by CHS genes from Vaccinium uliginosum with Vaccinium ashei, Rhododendron simsiiand and Actinidia chinensis were 99%, 93% and 93%, respectively. The phylogenic tree of amino acid sequences of the proteins encoded by CHS genes from Vaccinium uliginosum and other species revealed that Vaccinium uliginosum, Vaccinium ashei and Actinidia chinensis belonged to the same branch, and Vaccinium uliginosum was the most closely related to Vaccinium ashei.

Key words:Vaccinium uliginosum; Chalcone Synthase; cloning; sequence analysis