結核桿菌三種實驗方法的應用評估

陳杏媛，郭琴華

(吉安市中心人民醫院，江西　吉安343000)

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·檢驗與臨床·

結核桿菌三種實驗方法的應用評估

陳杏媛，郭琴華

(吉安市中心人民醫院，江西吉安343000)

摘要：目的比較痰涂片法、實時熒光定量PCR法和免疫結核抗體（金標法）檢測對結核病的診斷意義。方法選取2015年7月至2015年10月在我院診療疑似或確診患者172例，進行涂片抗酸染色、實時熒光定量PCR法檢測和采集血樣進行免疫結核抗體檢測。結果172例檢測樣本中，抗酸染色痰液標本陽性例數只有20例，陽性率為11.6%。實時熒光定量PCR法陽性例數55例，陽性率31.2%。免疫結核抗體（金標法）陽性例數為87例，陽性率為50.6%。結論三種方法中，以結核抗體陽性率最高，實時熒光定量PCR法次之，抗酸染色法陽性率最低。如果三種方法聯合運用，相互佐證，可提高準確性。

關鍵詞：結核桿菌；檢測方法

結核桿菌是引起結核病的病原菌，可侵犯全身器官，但以肺結核為多見。結核病至今仍為重要的傳染病，據WTO報道，每年約有800萬新病例發生，約300萬人死于該病。近年來，因艾滋病、吸毒等社會原因及免疫制劑的應用，其發病率呈上升趨勢[1]，在我國一些地區結核病已在感染性長期發熱的病因中上升至首位[2，3]。當前，對結核病的預防、診斷以及臨床治療已經成為我國重點解決的醫學課題[4]。通過早診斷、早治療，絕大多數的結核病患者均可以治愈[5]。長期以來，結核病的實驗室診斷是結核病防治的重點和難點[6]。鑒定結核桿菌的方法有很多，但各種方法的特異性和敏感性各不相同。本人對痰涂片染色法、實時熒光定量PCR法、免疫結核抗體（金標法）3種方法進行對比研究，以評價各種方法的優缺點和對臨床的應用價值。

1　材料與方法

1．1材料收集自2015年7月至2015年10月期間在我院診療疑似或確診結核病的患者標本172例。涂片法和實時熒光定量PCR法的標本為痰液。囑患者留取晨痰2~5ml (結核患者需停抗結核藥3天）結核抗體檢測則采靜脈血2ml。

1.2檢測方法

1.2.1涂片染色鏡檢是臨床常用的簡易快速的檢查方法：取痰或其他已處理好的標本0.1ml，于載玻片上均勻涂抹成2cm×2.5cm橢圓形范圍，以自然干燥和火焰固定后，進行抗酸染色，采用珠海貝索生物技術有限公司的結核染色液。染色步驟：⑴石碳酸復紅溶液染色20min；⑵5%鹽酸酒精脫色3min；⑶亞甲基藍溶液染色30s。

1.2.2實時熒光定量PCR法（試劑盒為中山大學達安基因公司產品）⑴取患者咳出的深部痰，痰液中加入4倍體積4%NaOH液化痰液，30min后吸1.5ml置EP內。⑵在金屬浴內100℃（3~5min）12000r/min，棄上清液。⑶加入生理鹽水約1.5ml混勻振蕩，離心棄上清液。⑷重復洗滌1次。⑸加入40μl DNA提取液在金屬浴100℃10min。⑹12000r/ min離心5min標本處理完畢。⑺離心取上清2μl 至PCR反應管內，反應管置定量PCR擴增儀內，按以下條件進行擴增：93℃2min預變性，93℃ ations in cardiovascular diseases：life style intervention [J]. Biomed Res Int，2014：801896. doi.10.1155/2014/801896.

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1.2.3免疫結核分枝桿菌抗體檢測（金標法）細菌在體內生長繁殖產生的代謝產物，刺激機體免疫系統產生特異性抗體，包括IgA、IgE、IgM、IgG，檢測這些抗體可幫助診斷分枝桿菌感染。將結核分枝桿菌特異性膜蛋白抗原分離純化，點樣并固化在硝酸纖維膜上。膜上TB抗原捕獲人血清樣品中結核分枝桿菌抗體，被捕獲的結核IgG抗體可用葡萄球菌A蛋白（SPA）能與IgG特異性結合），形成紅色斑點，根據是否出現紅色斑點即可判斷陰、陽性結果從而判斷是否存在結核分枝桿菌抗體標本要求必須使用新鮮的血清標本。血漿標本必須用玻璃剝離纖維蛋白，保證血清無混濁沉淀，以免吸入導致反應膜孔阻塞（試劑為上海奧普生物醫藥有限公司提供）。

1.3統計學分析運用SPSS 14.0軟件采用t檢驗進行統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

結核桿菌3種檢測方法結果比較：3種方法中，免疫結核抗體（金標法）陽性率最高，達50.6%。其次為實時熒光定量PCR法，陽性率為32.2%。陽性率最低為痰涂片法，陽性率僅為11.6%。三種檢測方法比較，陽性率差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　3種檢測方法的結果

3　討論

對于肺結核的實驗室診斷，痰涂片法是檢測抗酸桿菌最普遍使用的方法，具有快速、簡便、經濟、特異性高，但陽性率低，無法滿足對結核病的診斷需求[7]。實時熒光定量PCR法可在1d內完成臨床樣品處理、核酸提取和檢測全過程，具有反應快速、特異性好、靈敏度高等許多優點。通過比較，實時熒光定量PCR法和傳統的涂片法，兩者有較好的一致性；在不選擇病例的前提下，前者的陽性率比后者高3倍左右。而且定量PCR是在完全封閉狀態下實現PCR擴增和產物分析，完全杜絕了擴增產生污染而導致假陽性，結果真實可靠[8，9]。但該方法相對價格稍高，需較為昂貴的儀器和設施。免疫結核抗體檢測（金標法）是一種簡單、快速的檢測方法，且陽性率較高（50.6%）。而且試劑和樣品用量極少，無需儀器設備，簡化了繁瑣的常規操作過程，同時也減小了因操作引起的誤差。免疫結核抗體檢測（金標法）簡便、快速、適應單人份測定的特點，尤其適用于基層醫院。但是其靈敏度稍低，有一定的假陽性和假陰性，特異性稍差，結果判斷帶有一定的主觀性，缺乏有效的質控手段，其靈敏度和敏感性均有待提高[10]。如果三種方法聯合運用，相互佐證，尤其對臨床醫師高度懷疑為結核的病例，當用一種檢測方法為陰性時，就應采用其它兩種方法重新檢測，從而使結核患者的檢測準確性得以明顯提高，多方面滿足臨床需要，提高肺結核的診斷水平。

參考文獻

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中圖分類號：R446.19，R825.2，R378.91+2

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)03-0373-02

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.036

(收稿日期2016-01-11；修回日期2016-03-11)45s→55℃60s10個循環，93℃30s→55℃45s30個循環。擴增過程中儀器實時檢測熒光強度并分析增長曲線，根據Ct計算出樣本中DNA含量（基因拷貝數/ml）。陽性判斷標準為：增長曲線呈S型，最強熒光值增高20單位以上。 2016-03-14；修回日期2016-04-17)