75例血友病A患者內含子22及1基因倒位情況分析*

黃吉娥, 張　婧, 劉詠梅, 楊　芳, 曾小菁*

(1.貴州醫科大學附院， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州省腫瘤醫院， 貴州 貴陽　550004； 3.貴州醫科大學， 貴州 貴陽　550004)

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75例血友病A患者內含子22及1基因倒位情況分析*

黃吉娥1, 張婧2, 劉詠梅1, 楊芳3, 曾小菁1*

(1.貴州醫科大學附院， 貴州 貴陽550004； 2.貴州省腫瘤醫院， 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫科大學， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察血友病A(HA)患者凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因內含子22倒位和內含子1倒位情況。方法: 取75例HA患者靜脈血，采用長距離PCR擴增技術(LD-PCR)檢測內含子22和內含子1倒位情況, 觀察兩種內含子倒位發生率，同時觀察內含子22倒位在重型HA中的比例，比較有家族史和無家族史HA患者內含子22倒位發生率。結果: 檢出22號內含子倒位患者27例，檢出率36%(27/75)，全部為HA重型患者，占重型血友病A患者的57.4%(27/47)；27例中有21例有家族史，有家族史患者內含子22號倒位的發生率高于無家族史患者(P<0.05)；檢出內含子1倒位1例，占1.3%(1/75)。結論： FⅧ基因內含子22倒位患者患重型HA的幾率較高，內含子22倒位檢測在重型HA的基因診斷中具有重要意義。

[關鍵詞]血友病A； 凝血因子Ⅷ； 基因倒位； 診斷

血友病A(hemophilia A，HA)是一種由凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的X 連鎖遺傳性出血疾病, 男性患病率約為1/5 000。HA患者常出現自發性或外傷后出血不止, 嚴重威脅著患者的生命, 給患者家庭和社會帶來沉重的負擔[1]。為阻斷致病基因傳遞,防止新的HA患兒出生, 開展HA攜帶者檢測和產前診斷,對于降低HA的發病率和致殘率具有重要意義。FⅧ基因內含子22和1倒位是導致重型HA的重要的分子發病機制，內含子22和1倒位分析也是目前用于HA疾病基因診斷的主要技術[2]。本研究通過長距離PCR擴增技術(long distance-PCR,LD-PCR)檢測HA患者內含子22和1倒位情況，以期提高檢測預判的成功率及穩定性,進而成熟應用于地區HA家系及攜帶者調查。

1材料和方法

1.1研究對象

病例均選自血友病中心2012-2014年登記的HA患者75例，均為男性，年齡9個月～58歲(≤10歲者19例，11～30歲41例，>30歲患者15例)；有家族史者46例，無家族史者29例；根據FⅧ活性，分為輕、中、重型，重型患者47例(FⅧ活性<1%)，中間型患者24例(FⅧ活性1%～5%)，輕型患者4例(FⅧ活性>5%～40%)，血管性血友病因子(vWF)抗原正常，均符合張之南等[3]主編的第3版《血液病診斷及療效標準》HA的診斷標準。

1.2標本采集與處理

取靜脈血3 mL，用EDTA-Na2抗凝，充分混勻。血樣采集后1 h內將標本在室溫下以3 000 r/min離心5 min，取血漿層、白細胞層和紅細胞層分裝于已消毒的EP管中，儲存于-80 ℃冰箱內。使用經典的酚-氯仿法提取DNA。

1.3內含子22基因倒位的檢測

以FⅧ基因DNA序列(GeneBank參考序列：CM000685.2)為模板，應用軟件Primer 5設計引物，見表1。LD-PCR反應體系為 2×GC PCR 緩沖液 I 12.5μL , dNTP(2.5μmol，dGTP/7-deaza-dGTP=3/1)4 μL,引物P、Q、B (10μmol/L) 分別1、0.5、0.5 μL,模板基因組DNA 1 μL (約100 ng) , LA-Taq酶0.25 μL, 蒸餾水補足至25 μL；反應條件98 ℃預變性1 min,98 ℃變性10 s,68 ℃退火(延伸)10 min,10個循環后，98 ℃變性10 s,每一個循環的68 ℃退火(延伸)20 s，20個循環中,最后一次72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物檢測：取PCR擴增產物5 μL，與1 μL 6×上樣緩沖液混勻，在0.6%瓊脂糖凝膠(含0.5 m/L溴化乙錠)，1×TBE緩沖液的電泳槽中，恒壓50 V的電壓下電泳5 h，置凝膠成像系統觀察結果。

表1　內含子22倒位檢測所需引物序列及擴增片段長度

1.4內含子1基因倒位的檢測

雙管多重PCR反應包括Int1h-1和Int1h-2兩個體系，相關引物設計參照文獻[6]。內含子1倒位反應引物序列及片段大小見表2。Int1h-1反應體系： 10×LA 緩沖液Ⅱ(含Mg2+)2.5 μL,dNTP混合液2 μL,引物9F(10 μmol)、引物int1h-2F(10 μmol)、引物9CR(10 μmol)各1 μL,模板基因組DNA 2 μL (約200 ng),LA-Taq酶0.25 μL, 蒸餾水補足至25 μL；Int1h-2反應體系：10×LA緩沖液Ⅱ(Mg2+plus)2.5 μL,dNTP Mixture 2 μL,引物9F(10 μmol)、引物int1h-2F(10 μmol)、引物int1h-2R(10 μmol)各1 μL ,模板基因組DNA 2 μL (約200 ng),LA-Taq酶0.25 μL,蒸餾水補足至25 μL；反應條件94 ℃預變性5 min,94 ℃變性10 s,61 ℃退火30 s，

表2　內含子1倒位檢測所需引物序列及擴增片段長度

72 ℃延伸2 min,共30個循環后，最后一次72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物檢測：1.5%瓊脂糖凝膠，5 μL PCR產物加1 μL 6×上樣緩沖液產物混合上樣，DNA Marker為DL2000，在0.5×TBE電泳液中在恒壓100 V條件下電泳1 h，紫外燈下凝膠成像處理。

1.5統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗確切概率法進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1FⅧ基因內含子22倒位分析

75例HA患者中內含子22倒位患者27例，占36%,27例患者均為重型，占重型HA的57.4%(27/47)。FⅧ基因內含子22倒位的LD-PCR產物為11 kb，電泳結果見圖1。

注：M1及M2為 DNA Marker，N為正常對照，1、4、5、7、9、10可見11 kb條帶，提示存在內含子22倒位，2、3、6、8、11及N可見12 kb條帶，提示為正常圖1　HA患者及正常對照標本FⅧ基因內含子22倒位LD-PCR電泳結果Fig.1　F VIII intron 22LD-PCR electrophoresis results for HA patients and normal controls

2.2FⅧ基因內含子1倒位分析

根據擴增產物的片段長度進行判斷內含子1的倒位情況，75例HA患者中發現1例內含子1倒位，占1.3%(1/75)，電泳結果見圖2。HA患者內含子22倒位發生率36%高于內含子1倒位發生率(1.33%)，兩者比較差異具統計學意義(P<0.05)。

注：M1及M2為 DNA Marker， 2為1號內含子倒位HA患者標本；標本1，3為正常人圖2　HA患者及正常對照標本FⅧ基因內含子1倒位PCR擴增結果Fig.2　The PCR amplification results of FVIII intron 1 for HA patients and normal control specimens

2.3有、無家族史HA患者內含子22倒位發生率

27例檢測出內含子22倒位的患者中21例有較明確的家族史，6例無家族史，有家族史HA患者中內含子22倒位發生率及重型血友病患者的比例均高于無家族史患者(P<0.05)。見表3。

3討論

HA是由于FⅧ基因缺陷導致的一種臨床上最常見的遺傳性出血性疾病,FⅧ基因約186 kb,包括26個外顯子和25個內含子,其中內含子22最大，長達32 kb,為最大的內含子。導致HA的基因突變原因繁多,且有高度異質性,其中重型HA 基因突變多為大的DNA片段缺失、倒位或插入等。1993年Lakich證實了40%～50%的重型HA為內含子22 倒位所致,發生機制為FⅧ基因內存在一個基因FⅧA ,長達9.5 kb,與FⅧ基因轉錄方向相反,在FⅧ基因外上游約400 kb處有兩個與FⅧA 高度同源的核苷酸序列(具99.99 %同源性) FⅧA1,FⅧA2。FⅧA與其同源序列發生重組時就形成內含子22倒位,使1～22號外顯子與22～26號外顯子分離,嚴重破壞了FⅧ基因的結構。早先Lakich和Naylor等[4]多應用Southern 印跡法檢測內含子22倒位,操作周期長,過程復雜,且通常要使用同位素,而劉敬忠[5]等應用LD-PCR可快速檢測該基因缺陷,它應用P,Q ,B 三種引物進行擴增,如果確為內含子22倒位,則患者呈11 kb一條帶,攜帶者為11 kb,12 kb兩條帶,正常者為12 kb一條帶,該法檢測準確,且效率高。由于貴州省血友病家系對本病的認識普遍不高，故未能取得家系疑似攜帶者的標本，故本文僅就75例已經證實的HA患者進行內含子22倒位的檢測,實驗結果提示其中27例為內含子22倒位,占36% ,且均為重型血友病(FⅧ活性﹤1%)，與國內文獻報道一致〔6]。27例檢測出內含子22倒位的患者中有21例均有較明確的家族史，6例無家族史，有家族史的患者中內含子22倒位的發生率明顯高于無家族史患者。重型HA患者中有家族史與無家族史患病率比較差異具統計學意義。由以上結果可以看出將內含子22倒位作為家系調查和攜帶者篩查具有一定可行性和實際價值。

表3　有、無家族史HA患者內含子22倒位發生情況及FⅧ活性比較

(1)與無家族史HA患者比較，χ2=4.81，P<0.05；(2)與無家族史HA患者比較，χ2=6.97，P<0.05

內含子1倒位是僅次于內含子22倒位導致重型HA的另一個重要分子發病機制[7]。目前認為，內含子1倒位發生率為1.2%～5%。國內首次大宗進行內含子l倒位篩查研究報道發現內含子1倒位占1.26%(2/158)[8]，本研究發現內含子1倒位1例，占1.33%，與國內外報道相符。內含子1倒位的發生率低，不作為首選家系調查和攜帶者篩查。

3個FⅧA 同源性高達99.9%的序列中, 包括了長達3.5 kb的GC含量為65%的GC島, 尤其是其中近1 kb GC含量竟高達79%[9]，故擴增難度相當高，影響LD-PCR成敗的因素很多。諸如引物濃度、酶用量、特殊定制dNTPs、基因組DNA的質量及用量、退火延伸溫度及電泳分析等[5]。在實驗過程中發現，同樣的LD-PCR體系及條件下，部分標本可得到目的條帶，另外部分標本多次PCR均未見目的條帶，故推測在此實驗中影響實驗結果的關鍵在于基因組DNA的質量，采用鹽析法及試劑盒提取DNA結果均不如意，酚-氯仿法仍是提取高質量DNA的經典方法，但操作過程很重要，每一步的手法必須輕柔，時間必須足夠且可適當延長，并將飽和酚及氯仿∶異戊醇的步驟各增加一次，以得到純度更高的DNA。通過提高DNA質量，原來未出現目的條帶的標本均出現了目的條帶。但實驗的穩定性仍較差，考慮到LD-PCR體系加樣極微量，實驗室現有條件不能達到，嚴重影響加樣的精確性，固采用混合加樣后分裝代替以前的逐個加樣，實驗的穩定性得到一定程度的鞏固。

總之，目前LD-PCR是檢測HA患者內含子22倒位的首選方法，內含子22倒位檢測在重型HA的基因診斷及發病機理研究中具有重要意義，以后進一步擴大研究,明確該倒位對于患者家系優生優育的價值。

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(2016-04-10收稿，2016-06-13修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

*通信作者E-mail:zengxiaoqing@hotmoul.com

[中圖分類號]R554.11

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)07-0810-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.016

Analysis of Gene Inversion of Introns 22 and Introns 1 in 75 Patients with Hemophilia A

HUANG Gie1, ZHANG Jing2, LIU Yongmei1, YANG Fang3, ZENG Xiaojing1

(1.theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuizhouCancerHospital,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the inversion of intron 22 and intron 1 in coagulation factor VIII gene of patients with hemophilia A(HA). Methods: Venous blood was taken from 75 cases of HA patients. Long range PCR amplification technology (LD-PCR) was adopted to detect intron 22 and intron 1 inversion. Two introns inversion occurrence was observed, and the intron 22 inversion proportion in severe HA patients was observed. The intron 22 inversion incidence was compared between patients of HA family history and no HA family history. Results: 27 patients with intron 22 inversion were found among the 75 patients, and detection rate was 36 %.All of 27 were severe HA patients, accounting for 57.4% of total 47 cases of severe HA patients(27/47) . In 27 cases, there were 21 cases with family history, and the incidence of intron 22 inversion was higher than that in patients with no family history (P<0.05). There was 1 case of intron 1 inversion, accounting for 1.3% (1/75). Conclusions: There is a higher probability of F VIII gene intron 22 inversion in severe HA patients, and intron 22 inversion detection has important significance in severe HA patients gene diagnosis.

[Key words]hemophilia A; coagulation factor VIII; gene inversion; diagnosis

網絡出版時間：2016-07-17網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.026.html