云南漢族人群脂聯素基因啟動子區多態性與宮頸癌的相關性*

張　禹， 嚴志凌， 史　荔， 楊宏英， 楊家方， 俞建昆， 張新文， 劉舒媛， 李傳印， 姚宇峰**

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院 醫學生物學研究所， 云南 昆明　650118； 2.云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室， 云南 昆明　650118； 3.昆明醫科大學附屬第三醫院， 云南 昆明　650106)

?

·基礎研究·

云南漢族人群脂聯素基因啟動子區多態性與宮頸癌的相關性*

張禹1，2， 嚴志凌3， 史荔1,2， 楊宏英3， 楊家方1，2， 俞建昆1,2， 張新文1,2， 劉舒媛1,2， 李傳印1，2， 姚宇峰1,2**

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院 醫學生物學研究所， 云南 昆明650118； 2.云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室， 云南 昆明650118； 3.昆明醫科大學附屬第三醫院， 云南 昆明650106)

[摘要]目的： 探討脂聯素基因啟動子區單核苷酸多態(SNP)與宮頸癌的相關性。方法： 選取云南地區漢族女性人群中宮頸癌患者395例組為癌癥組、癌前病變者131例為癌前病變組，正常健康體檢者685例作為對照組，采用TaqMan探針基因分型方法對3組人群外周血DNA中脂聯素基因啟動子區的3個SNP位點rs266730(G>A)、rs266729(C>G)和rs16861194(A>G)進行基因分型，并構建單倍型，評估上述3個SNP位點及單倍型與宮頸癌的相關性。結果： 癌癥組、癌前病變組及對照組間脂聯素基因啟動子區的3個SNP位點rs266730(G>A)、rs266729(C>G)和rs16861194(A>G)的基因頻率和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)； rs266730(G>A)、rs266729(C>G)和rs16861194(A>G)構建的單倍型頻率在癌癥組、癌前病變組和對照組中的差異無統計學意義(P>0.05)。結論： 在云南漢族女性群體中，脂聯素基因啟動子區的rs266730(G>A)、rs266729(C>G)和rs16861194(A>G)3個SNP位點多態性與宮頸癌的發生無關。

[關鍵詞]宮頸腫瘤； 癌前狀態； 多態性，單核苷酸； 基因型； 脂聯素

女性腫瘤中宮頸癌的發病率僅次于乳腺癌，每年約有超過500 000的新發病例，病死率為50.36%，有近90%的宮頸癌發生在發展中國家，而中國每年約有13.5萬新發病例，占世界新發病例的30%[1]。現已證實許多單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP) 位點可能會引起基因功能的改變，與宮頸癌的發生、發展密切相關[2]。脂聯素是一種主要由白色脂肪組織分泌的多肽類激素，與代謝密切相關，可抑制炎癥因子的產生，對抗氧化應激，從而阻止惡性腫瘤的進展[3]。研究表明體內循環脂聯素水平與結直腸癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7-8]等癌癥的患病風險存在負相關。Harak和Vasseur等[9-10]對在日本和法國人群檢測脂聯素基因組時發現，脂聯素基因啟動子區有三個高頻的SNP位點分別為-11426A>G(rs16861194)、-11391G>A(rs17200539)和-11377C>G(rs266729)。Laumen 等[11]發現脂聯素基因啟動子區的SNP-11426A>G(rs16861194)和-11377C>G(rs266729)可以調控啟動子的活性，這些變異會影響脂聯素水平，本課題組前期研究發現，云南漢族人群脂聯素基因啟動子區位點-11426A>G(rs16861194)、-11377C>G(rs266729)和-12140G>A(rs266730)的變異頻率均大于1%。有研究報道肺癌患者中rs266730(G>A)的分布與正常人存在差異，A基因是肺癌的保護性基因[12]。本研究選取脂聯素基因啟動子區3個SNP位點rs266730(G>A)、rs266729(C>G)和rs16861194(A>G)進行基因分型及單倍型構建，以正常人群作為對照，對癌前病變與宮頸癌患者進行分層分析，探討脂聯素基因啟動子區SNP位點在宮頸癌發生發展中的作用。

1材料與方法

1.1標本來源

根據“知情同意”原則，隨機選取2012年10月～2016年2月住院確診為宮頸癌患者及癌前病變患者526例作為病例組。宮頸癌患者395例作為癌癥組，鱗癌344例，腺癌46例，鱗腺癌5例；癌前病變患者131例作為癌前病變組。診斷標準依據《臨床診療指南-婦產科學分冊》，年齡30～75歲，采用FIGO分期系統對宮頸癌進行臨床分期。排除術前接受放化療等抗腫瘤治療的病例，排除患有其他惡性腫瘤或合并心血管疾病、糖尿病、肝炎、腎病等疾病的患者及資料不全者。2013年10月～2015年10月685例正常體檢者作為對照組，30～75歲，HPV檢測為陰性無宮頸病變的健康女性。病例組與對照組年齡比較，差異無統計學意義(t=-1.557，P>0.05)。所有被檢者均為居住于云南地區，彼此無血緣關系的漢族個體。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取采集所有被檢者空腹靜脈血5 mL，用EDTA 或肝素抗凝，使用QIAGEN血基因組DNA 小量試劑盒提取DNA，并以超微量紫外可見分光光度計(ND-2000，美國ThermoScientific公司)檢測DNA的濃度和純度。

1.2.2標準品以3個已知基因型(野生純合子、突變純合子、雜合子)的樣品作為標準對照(均為本課題組經基因測序樣本驗證)，SNP-rs266730(G>A)樣本的野生純合子、突變純合子、雜合子的基因型分別是GG、AA及AG， rs266729(C>G)為CC、GG及CG ，rs16861194為(A>G)AA、GG及AG。在每次進行TaqMan探針熒光定量PCR檢測SNP位點的基因分型時，標準對照樣品與待分型樣品統一進行檢測并分型。

1.2.3基因分型檢測采用TaqMan探針熒光定量PCR方法檢測SNP位點的基因分型(羅氏LightCycler 480 實時熒光定量PCR 儀)，TaqMan探針、引物和SNP分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix)均購自美國ABI公司，針對每個SNP 位點所設計的2 條探針分別用VIC 和FAM 熒光標記。rs266730(G>A)、rs266729(C>G)及rs16861194(A>G)引物序列根據在美國ABI公司網站(http://www.appliedbiosystems.com)的ID號(AHZAH26、 C_2412786_10及C_33187775_10)合成。PCR 反應體積為10 μL，反應條件95 ℃預變性10 min，92 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min，共40 個循環，40 ℃長延伸5 min。以3 個已知基因型的標準樣品作為對照。結果采用羅氏LightCycler 480 基因分型軟件(LCS480 1.5.1.62)進行分析和基因分型。對部分TaqMan 分型結果進行測序驗證。

1.3統計學方法

Hardy-Weinberg平衡檢驗樣品的代表性。對照組和病例組年齡采用t檢驗，癌癥組、癌前病變組和對照組性別差異以及脂聯素基因啟動子區SNP 位點基因型和等位基因頻率差異采用χ2檢驗。SHEsis 軟件程序計算連鎖不平衡，用D＇表示，D＇值為0時，連鎖完全平衡；D＇值為1 時，連鎖完全不平衡；D＇>0.8時，認為存在連鎖。構建脂聯素基因啟動子區域的3個SNP位點的單倍型[13-14]，并用χ2檢驗檢測單倍型頻率在癌癥組、癌前病變組與對照組之間的差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1脂聯素基因SNPs 位點的等位基因與基因型頻率

Hardy-Weinberg平衡檢驗結果表明，脂聯素基因啟動子區3個SNP 位點在病例組和對照組中的基因型分布全部符合Hardy-Weinberg平衡(表1)，提示所用樣本具有群體代表性。癌癥組、癌前病變組和對照組中rs266730(G>A)、rs266729(C>G)及rs16861194(A>G)3個SNPs等位基因分別以G、C及 A為主，基因型以GG、CC 及AA為主；脂聯素基因3個SNPs 位點等位基因和基因型頻率在癌癥組、癌前病變組和對照組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；見表2。

2.2脂聯素基因SNPs 位點連鎖不平衡檢測

連鎖不平衡分析顯示，癌癥組與對照組比較，rs266729(C>G)與rs266730(G>A)、rs266729(C>G)與rs16861194(A>G)間存在強連鎖(D’=0.870、0.903)，rs266730(G>A)與rs16861194(A>G)關聯不明顯(D′=0.665)；在癌癥組與癌前病變組的比較中，rs266729(C>G)與rs266730(G>A)、rs266729(C>G)與rs16861194(A>G)及rs266730(G>A)與rs16861194(A>G)間存在強連鎖(D’=0.906、0.822、0.803)；癌前病變組與對照組比較，rs266729(C>G)與rs266730(G>A)、 rs266729(C>G)與rs16861194(A>G)存在強連鎖(D’= 0.901、0.999)，rs266730(G>A)與rs16861194(A>G)關聯不明顯(D’=0.668)。

表1　病例組與對照組本3個SNP位點Hardy-Weinberg平衡檢驗

表2　癌癥組、癌前病變組和對照組脂聯素基因啟動子區3個SNP位點的基因頻率及等位基因頻率分布

2.3脂聯素基因啟動子區SNPs位點單倍型構建及頻率

根據連鎖不平衡結果構建脂聯素基因啟動子區3個SNP位點的單倍型。構建單倍型是僅選擇強連鎖的SNP位點進行構建，結果顯示，構建的單倍型頻率在癌癥組、癌前病變組和對照組中的分布差異無統計學意義(P>0.05)，見表3和表4。

表3　構建的脂聯素基因啟動子區3個SNP位點的單倍型在癌癥組與癌前病變組中的分布

(1)代表群體單倍型出現頻率<3%時，不進行統計學分析

表4　脂聯素基因啟動子區3個SNP位點單倍型在癌癥組和癌前病變組的分布

(1)群體單倍型出現頻率<3%時，不進行統計學分析

3討論

宮頸癌的發生發展與高危型HPV感染密不可分。然而，盡管95%以上的宮頸癌患者中均發現了HPV病毒的癌蛋白表達，但不是每一個感染高危型HPV的患者均發展為宮頸癌。宮頸癌的發生除與外部環境有關，宿主自身的遺傳背景對宮頸癌的發生發展也起著重要的作用。研究表明，血漿脂聯素水平與一些惡性腫瘤的發生發展密切相關[15]。腫瘤患者血漿脂聯素水平偏低，并且腫瘤細胞表達脂聯素受體，脂聯素與腫瘤的發生存在某種聯系[16]。脂聯素可與脂聯素受體結合，并激活受體和下游的信號轉導通路。脂聯素還可以選擇性地抑制多種促有絲分裂因子(如血小板衍生生長因子BB、堿性成纖維生長因子等)來抑制腫瘤的增殖[17]。直接作用于腫瘤細胞，或者通過誘導血管內皮細胞凋亡，可抑制血管生成[18-19]。血清脂聯素水平與惡性腫瘤密切相關。脂聯素基因在轉錄水平上受到多種轉錄因子的調控，可通過其啟動子區的順式作用元件或第一個內含子區而調控脂聯素基因的表達[11, 20]。推測位于脂聯素基因啟動子區域的SNP可能影響脂聯素基因的表達。近年來，大量的研究證明脂聯素基因SNP與癌癥的發生密切相關。Preet K.Dhillon等[7]在美國男性中檢測了13個脂聯素基因SNP位點，發現脂聯素基因SNP位點rs266729、rs182052、rs822391及rs2082940與前列腺癌的發生相關，同時發現SNP位點與血漿脂聯素水平相關。在中國漢族男性中，脂聯素的3個SNP(rs3774262、rs266729和rs182052)，除rs3774262與前列腺癌的發生(P=0.04)及血漿脂聯素水平密切相關外，rs266729和rs182052與前列腺癌的發生和血漿脂聯素水平無關[8]。課題組前期研究證實肺癌組織中脂聯素基因啟動子區的SNP-rs266730G>A的A基因是肺癌的保護性基因[12]。本研究應用Taqman assay進行基因分型，研究脂聯素基因啟動子區域的SNPs與宮頸癌發生發展的關系，結果發現在云南漢族女性人群中，脂聯素基因啟動子區SNP-rs266729(C>G)、rs266730(G>A)和rs16861194(A>G)基因頻率及等位基因頻率與宮頸癌發生無關(P>0.05)。原因可能為上述三個SNP在不同個體的單倍型組合并未影響到轉錄因子與脂聯素基因啟動子的結合能力，進而未影響脂聯素基因的表達，也可能是在云南漢族的遺傳背景下，上述3個SNP在云南漢族女性人群中的遺傳易感性相同，或相同的SNP位點對于不同的癌癥類型的作用不盡相同。

綜上所述，在云南漢族群體中，脂聯素基因啟動子區SNP-rs266729C>G、rs266730G>A和rs16861194A>G與宮頸癌的發生無關。課題組將進一步對宮頸癌患者的血清脂聯素水平進行測量，完成從脂聯素基因啟動子區SNP到血清脂聯素水平再到宮頸癌發生發展的研究，從各方面驗證脂聯素與宮頸癌發生發展的聯系。為宮頸癌的早期診斷尋找重要的分子靶標，也為宮頸癌的早發現和早治療提供依據。

4參考文獻

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012 [J]. CA cancer J Clin, 2015(65): 87-108.

[2] Mehta AM, Spaans VM, Mahendra NB, et al. Differences in genetic variation in antigen-processing machinery components and association with cervical carcinoma risk in two Indonesian populations [J]. Immunogenetics, 2015(67): 267-275.

[3] Xing SQ, Zhang CG, Yuan JF, et al. Adiponectin induces apoptosis in hepatocellular carcinoma through differential modulation of thioredoxin proteins [J]. Biochem Pharmacol, 2015(93): 221-231.

[4] Ahn KY, Lee MK, Kim DI, et al. Cardiopulmonary fitness, adiponectin, chemerin associated fasting insulin level in colorectal cancer patients [J]. Supporti Care Cancer, 2016 (7):2927-35.

[5] Diakowska D, Markocka-Maczka K, Szelachowski P, et al. Serum levels of resistin, adiponectin, and apelin in gastroesophageal cancer patients [J]. Dis Markers, 2014(2014): 619-649.

[6] Ahmed SD, Khanam A, Sultan N,et al. Serum adiponectin level association with breast Cancer risk: evidence from a Case-Control Study [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2015(16): 4945-4948.

[7] Dhillon PK, Penney KL, Schumacher F, et al. Common polymorphisms in the adiponectin and its receptor genes, adiponectin levels and the risk of prostate cancer [J]. Cancer Epidemioc Biomarkers Prev, 2011(20): 2618-2627.

[8] Gu CY, Li QX, Zhu Y, et al. Genetic variations of the ADIPOQ gene and risk of prostate cancer in Chinese Han men [J]. Asian J Androl, 2014(16): 878-883.

[9] Hara K, Boutin P, Mori Y, et al. Genetic variation in the gene encoding adiponectin is associated with an increased risk of type 2 diabetes in the Japanese population [J]. Diabetes, 2002(51): 536-540.

[10]Vasseur F, Helbecque N, Dina C, et al. Single-nucleotide polymorphism haplotypes in the both proximal promoter and exon 3 of the APM1 gene modulate adipocyte-secreted adiponectin hormone levels and contribute to the genetic risk for type 2 diabetes in French Caucasians [J]. Hum Mol Genet, 2002(11): 2607-2614.

[11]Laumen H, Saningong AD, Heid IM, et al. Functional characterization of promoter variants of the adiponectin gene complemented by epidemiological data [J]. Diabetes, 2009(58): 984-991.

[12]Li Y, Yao Y, Qian X, et al. The association of adiponectin gene promoter variations with non-small cell lung cancer in a Han Chinese population [J]. PloS one, 2015(10): e0127751.

[13]Li Z, Zhang Z, He Z, et al. A partition-ligation-combination-subdivision EM algorithm for haplotype inference with multiallelic markers: update of the SHEsis (http://analysis.bio-x.cn) [J]. Cell research, 2009(19): 519-523.

[14]Shi YY, He L. SHEsis, a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium, haplotype construction, and genetic association at polymorphism loci [J]. Cell Res, 2005(15): 97-98.

[15]Nagaraju GP, Rajitha B, Aliya S, et al. The role of adiponectin in obesity-associated female-specific carcinogenesis [J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2016.

[16]Sakellariou S, Fragkou P, Levidou G, et al. Clinical significance of AGE-RAGE axis in colorectal cancer: associations with glyoxalase-I, adiponectin receptor expression and prognosis [J]. BMC Cancer, 2016(16): 174.

[17]Wang Y, Lam KS, Xu JY, et al. Adiponectin inhibits cell proliferation by interacting with several growth factors in an oligomerization-dependent manner [J]. J Biol Chem, 2005(280): 18341-18347.

[18]Shimano M, Ouchi N, Shibata R, et al. Adiponectin deficiency exacerbates cardiac dysfunction following pressure overload through disruption of an AMPK-dependent angiogenic response [J]. J Mol Cell Cardiol, 2010(49): 210-220.

[19]Motoshima H, Wu X, Mahadev K, et al. Adiponectin suppresses proliferation and superoxide generation and enhances eNOS activity in endothelial cells treated with oxidized LDL [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004(315): 264-271.

[20]Ong KL, Li M, Tso AW, et al. Association of genetic variants in the adiponectin gene with adiponectin level and hypertension in Hong Kong Chinese [J]. Eur J Endocrinoc, 2010(163): 251-257.

(2016-03-15收稿，2016-05-26修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

*基金項目]國家自然基金項目(31270030； 81573206); 協和青年基金(3332015149); 云南省科技廳-昆明醫科大學應用基礎研究聯合專項(2013FB169); 云南省婦科腫瘤內設研究機構中心(2014NS032); 中國醫學科學院病原生物學研究所基本科研業務費項目(2012IPB107)

[中圖分類號]R737.33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)07-0770-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.006

Study of Correlation Between SNPs in Adiponectin Gene Promoter Region and Occurrence and Development of Cervical Cancer in Yunnan Han Population

ZHANG Yu1,2, YAN Zhiling3, SHI Li1,2, YANG Hongying3, YANG Jiafang1,2, YU Jiankun1,2,ZHANG Xinwen1,2, LIU Shuyuan1,2, LI Chuanyin1,2, YAO Yufeng1,2

(1.InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Kunming650118,Yunnan,China; 2.YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearch&DevelopmentonSevereInfectiousDisease,Kunming650118,Yunnan,China; 3.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650106,Yunnan,China)

[Abstract]Objective: To evaluate the association of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the adiponectin gene promoter region with the occurrence and development of cervical cancer in Yunnan Han population. Methods: 395 patients with cervical cancer were enrolled as cancer group, 131 patients of precancerous lesion as CIN III group and 685 healthy individuals as control group. Three SNPs in the promoter region of adiponectin gene including rs266730(G>A), rs266729(C>G) and rs16861194(A>G) were genotyped by TaqMan method. The haplotypes were constructed and the association of these three SNPs and haplotypes with the occurrence and development of cervical cancer was analyzed. Results: In terms of both the allelic and genotypic frequency, these three SNPs (rs266730, rs16861194 and rsr266729) showed no statistically significant difference between cancer group, CIN III group and control group(P>0.05). The frequencies of haplotypes constructed by rs266730(G>A), rs266729(C>G) and rs16861194(A>G) also showed no statistically significant difference between cancer group, CIN III group and control group(P>0.05). Conclusion: These three SNPs in the adiponectin gene promoter region are not associated with the occurrence and development of cervical cancer in the Han population in Yunnan province.

[Key words]cervical cancer; precancerous condition; polymorphisms,single nucleotide; genotype; adiponectin

**通信作者 E-mail:leoyyf@gmail.com

網絡出版時間：2016-07-17網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.008.html